研究背景恶性肿瘤已经成为危害人类生命健康、降低人们生活质量的重要疾病之一,我国恶性肿瘤每年的发病率和死亡率均呈上升之势,而外科手术治疗、放疗和化疗等传统治疗方法恶性肿瘤都各有其弊端,治疗后都会对患者的免疫力产生消极的影响,对于恶性程度较高、易复发且难治的恶性肿瘤缺乏有效的治疗方法,因此,寻找一种新型的、有效的治疗恶性肿瘤的方法势在必行。近年来,肿瘤细胞免疫治疗越来越受到科学家和医务工作者的关注。肿瘤细胞免疫治疗是一种自体细胞回输的过继性免疫细胞治疗手段,通过生物技术获取肿瘤患者外周血中免疫细胞以及对患者免疫细胞的体外修饰,重新静脉回输至患者体内,使机体重新获得特异性杀伤恶性肿瘤细胞的能力。肿瘤细胞免疫治疗最大的优势就是其安全性和有效性,回输自体细胞避免了免疫排斥反应,同时,免疫修饰使免疫细胞杀伤肿瘤细胞更精确,由此看来,肿瘤细胞免疫治疗弥补了手术、化疗和放疗的缺点,为恶性肿瘤的彻底根治奠定了基础。抗原嵌合受体(CAR)T细胞正是基于对患者外周血T细胞进行基因修饰,回输体内从而实现自体细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤功能,因此,CAR-T细胞免疫治疗已经成为生物治疗领域的关注重点,为复发、难治肿瘤患者带来了治愈的希望;基于CD19在B淋巴细胞表面表达的特异性,CD19 CAR-T细胞治疗已经使不少患者达到了完全缓解,甚至治愈;但是,B淋巴细胞恶性肿瘤并非对CD19 CAR-T细胞治疗均敏感,如何提高CD19 CAR-T细胞的治疗效果成为很多专家学者研究的重点。无论是在内分泌疾病还是肿瘤治疗领域,糖代谢已经成为其疾病发生发展中不可忽略的一个环节。目前,有研究表明糖代谢在肿瘤细胞的增殖和凋亡中也有着举足轻重的影响。而糖代谢不仅影响肿瘤细胞的增殖和凋亡,其对免疫细胞功能的发挥也有重要的影响。二甲双胍,作为Ⅱ型糖尿病一线用药,在调节糖代谢和改善胰岛素抵抗方面有着突出的优势,研究表明,二甲双胍可以抑制肿瘤细胞糖代谢,从而抑制肿瘤细胞的生长,起到预防和治疗的目的。然而,二甲双胍对于CAR-T细胞的影响及作用机制迄今无人探究,因此,本课题意在研究二甲双胍对CD19 CAR-T细胞的影响,并探讨作用机制。研究目的研究二甲双胍对CD19 CAR-T细胞增殖、凋亡及细胞毒性作用的影响,并探讨其作用机制。研究方法1.采用分子生物学方法构建PGK-EGFP-CD19 CAR慢病毒质粒,脂质体转染法进行病毒包装,对人外周血T淋巴细胞进行慢病毒转染,流式细胞仪检测T细胞慢病毒转染率;2.CCK-8细胞增殖实验及细胞计数板计数法评估二甲双胍对CD19 CAR-T细胞增殖的影响;3.流式细胞仪检测二甲双胍对CD19 CAR-T细胞凋亡的影响;4.CD19 CAR-T细胞与肿瘤细胞按照一定的效靶比(E:T)共培养,流式细胞仪评估二甲双胍对CD19 CAR-T细胞杀伤能力的影响,ELISA法检测细胞因子的释放;5.Western blotting验证二甲双胍通过AMPK-mTOR-HIF1 α信号转导途径影响CD19 CAR-T细胞增殖、凋亡及细胞毒性作用。研究结果1.二甲双胍抑制CD19 CAR-T细胞增殖,并促进其凋亡;2.二甲双胍降低CD19 CAR-T细胞杀伤肿瘤细胞的能力,抑制其细胞因子的释放;3.二甲双胍激活AMPK,进而抑制mTOR的表达,最终HIF1α表达下调;4.AMPK抑制剂逆转二甲双胍的消极作用,但未影响mTOR及HIF1α的表达,二甲双胍对CD19 CAR-T细胞的作用存在AMPK依赖性。结论二甲双胍通过AMPK-mTOR-HIF1 α信号转导途径抑制CD19 CAR-T细胞增殖和细胞毒性作用,促进其凋亡。