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1.1目的煤工尘肺(coal workers’pneumoconiosis,CWP)指煤矿工人长期吸入生产性粉尘所引起所引起肺部病变的总称。随着对煤工尘肺认识的逐渐深入,人们已发现其多种并发症可使病情恶化甚至死亡。煤工尘肺患者由于长期吸入生产性粉尘,使肺功能受损,造成慢性持续性缺氧。低氧血症会导致多器官的损害,尤其是需氧量较大的中枢神经系统。在缺氧与细胞凋亡关系研究中,发现缺氧对细胞凋亡具有诱导作用。神经细胞凋亡可引起脑功能障碍。现在人们普遍认为，线粒体是凋亡的执行者。同时线粒体在细胞凋亡调节中也十分重要,绝大多数蛋白分子通过线粒体起到调节凋亡的作用。由于煤工尘肺患者的慢性持续缺氧需较长时间才能导致认知障碍病等较严重的并发症,故在人体进行煤工尘肺并发认知障碍研究有一定的局限性,所以研制煤工尘肺动物模型对于阐明煤工尘肺致认知功能障碍及其机制非常重要。本实验旨在建立理想的煤工尘肺大鼠模型,研究煤工尘肺对大鼠海马神经元凋亡和认知功能的影响,为探讨煤工尘肺患者认知功能障碍的发生机制提供必要的实验依据。1.2方法1.2.1慢性持续性缺氧的煤工尘肺大鼠模型的制备取健康3月龄雄性Wistar大鼠60只,所有大鼠先饲养一周,使其适应新环境。大鼠随机分为2组,即对照组和煤工尘肺(CWP)组,每组30只。用10%水合氯醛(300mg/kg)腹腔麻醉,然后行气管插管,将颗粒直径<5μm的煤粉尘配成50 g/L的生理盐水悬液,CWP组灌入煤尘生理盐水悬1 ml,对照组灌入1 ml生理盐水。所有大鼠正常饲料喂养,饮水与活动均不限。实验时间为16周。1.2.2学习记忆能力测定两组分别取十只于第4、8、16周通过水迷宫实验检测大鼠学习及记忆能力。①定位航行实验(place navigation):检验大鼠的学习记忆能力。②空间探索实验(spatial probe):检测大鼠的空间记忆能力。1.2.3血气分析测定于第4、8、16、周水迷宫实验后,腹腔麻醉,解剖开腹,用血气针取腹主动脉血0.5ml,作血氧分压的检测。1.2.4形态学实验检测实验结束时处死大鼠,取肺组织和脑组织做HE病理切片观察光镜下肺组织和脑组织结构的变化。取海马组织用TUNEL法检测神经细胞的凋亡情况。免疫组化法检测BCL-2/BAX蛋白表达变化情况。1.3结果1.3.1大鼠学习记忆测量结果水迷宫实验结果显示,各组别学习记忆能力差别有统计学意义(p<0.05),CWP组4周、8周、16周差异有统计学意义(p<0.05)。正常组间比较不认为差异有统计学意义(p>0.05)。1.3.2慢性持续性缺氧下的血气分析和肺组织病理切片结果尘肺组大鼠动脉血氧分压与对照组相比明显降低,已经是慢性持续性低氧状态。染尘4周时可见炎细胞浸润增加,吞噬了煤尘的肺泡巨噬细胞增加及煤尘聚集形成的煤斑或结节增多,病灶肺气肿明显,染尘8、16周可见肺纤维化形成,符合煤工尘肺的病理特点。因此,从肺组织病理改变和慢性持续性缺氧状态来看此模型符合人类煤工尘肺的诊断标准。1.3.3海马组织病理切片实验结果海马组织病理形态学观察：光镜下,大鼠在染尘4周时,海马区变性神经元数量增多,胞体深染,排列散乱；在8周、16周时可见胶质细胞吞噬神经元,神经元坏死、减少,筛网状软化灶。采用TUNEL法检测海马区凋亡神经元。神经元胞核中有棕黄色颗粒的为阳性细胞。多组凋亡率指标之间的差别有统计学意义(p<0.05),正常组间比较差异不认为有统计学意义(p>0.05)。CWP组大鼠海马区凋亡神经元数目增多,明显高于对照组,两组比较有统计学差异(p<0.05)。1.3.4大鼠海马区BCL-2/BAX免疫组化结果光镜下见阳性细胞胞浆内出现棕黄色颗粒,各组均可见免疫组化染色的阳性表达细胞。但与对照组相比,CWP组BCL-2蛋白表达减少,BAX蛋白表达增加。经过析因分析可知两组蛋白表达差异有统计学意义,细胞凋亡率与BCL-2/BAX比值的相关性分析用spearman相关分析,二者呈负相关(p<0.01)。1.4结论(1)煤工尘肺大鼠学习记忆能力下降；(2)慢性持续性缺氧可引起海马区凋亡调控蛋白表达发生变化,神经元凋亡率增加,可能为尘肺鼠认知障碍的发生机制之一。