背景肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是世界上常见的六大恶性肿瘤之一，其死亡率居全球恶性肿瘤死亡率的第三位。目前，HCC患者预后极差，5年生存率低于5%，而导致HCC预后极差的主要原因之一是大多数HCC患者确诊时已处于中晚期，错过了最佳治疗时机。因此，对HCC高危人群（慢性肝硬化患者、乙肝及丙肝病毒携带者）进行随访、定期筛查，是发现早期HCC患者和降低HCC发病率及死亡率的有效手段之一。AFP诊断HCC的敏感性（40-65%）和特异性（76-96%）均不理想，尤其是HCC的早期诊断。因此，亟需寻找HCC早期诊断的新型生物标志物。蛋白质糖基化是蛋白质最常见和最重要的翻译后修饰，糖蛋白的寡糖侧链参与如蛋白质正确折叠、细胞间或细胞内信号传导、细胞粘附和迁移、胚胎发育及炎症等生理或病理过程。尤其重要的是，蛋白质的异常糖基化与恶性肿瘤等多种疾病的病理过程密切相关。大量研究表明：许多肿瘤形成和进展过程中均涉及蛋白质的异常糖基化，异常糖基化能增加肿瘤细胞的粘附和迁移能力，从而导致肿瘤细胞发生局部浸润和远处转移。目前，临床上常用的肿瘤诊断生物标志物和药物治疗靶点多为糖蛋白，如AFP/AFP-L3（HCC）、CEA（胰腺癌）、PSA（前列腺癌）、CA153与CEA（乳腺癌）、CA125（卵巢癌）等。本课题组前期发现：组织蛋白酶D前体（Pro-cathepsin-D，pCD）在HCC组织中显著高表达，因此，本研究分析与刀豆蛋白凝集素A（ConcanavalinA，ConA）特异结合的pCD（ConA-pCD）在HCC组织、HCC细胞系及HCC患者血清中的表达规律,并分析其异常表达的临床意义。目的本研究采用ConA亲和层析法分别分离纯化组织（HCC及癌旁非癌肝组织）、细胞（肝永生化细胞系及肝癌细胞系）和血清（HCC、肝硬化、慢性肝炎及健康对照）来源的N-连接糖蛋白，Western blot检测ConA-pCD的表达变化并分析其异常表达的临床意义；选择CD/pCD高表达HCC细胞系（SNU449、SNU473）进行靶向沉默，观察CD/pCD沉默后对体外HCC细胞转移能力影响，为CD/pCD的分子靶向治疗提供实验依据。1材料与方法1.1研究对象1.1.1组织标本3例正常肝组织和10对HCC及癌旁非癌肝组织来自香港中文大学（-86℃保存），所有HCC均经组织病理学诊断确诊，男性7例，女性3例，平均年龄62.80±10.46岁；1.1.2血清标本15例HCC（男性11例，女性4例，平均年龄58.20±10.88岁）、28例肝硬化（男性21例，女性7例，平均年龄47.89±10.97岁）、19例慢性肝炎（男性14例，女性5例，平均年龄33.16±13.15岁）来自开封市第六人民医院，30例健康对照血清来自志愿者。所有HCC患者均经组织病理学或影像学检查确诊；1.1.3细胞标本HCC细胞系（Huh7、7721、SNU449、SNU473、PLC/PRF/5、HepG-2）及人肝永生化细胞系（L02、Change Liver）由本实验室保存，均5%CO2、37C培养箱、含10%胎牛血清RPMI-1640培养。1.2标本处理及蛋白提取采用NP-40裂解法提取HCC及肝组织蛋白，Bradford法测定蛋白浓度；采集患者或对照晨起空腹血，室温静置1-2h，4℃1500rpm离心后取上清，分装后于-80℃保存备用；细胞至汇合度70-80%时，预冷PBS洗涤细胞，换无血清培养基过夜培养，收集分泌上清，超滤法浓缩后备用；胰酶消化细胞，PBS洗涤3次，采用NP-40裂解液提取细胞蛋白。1.3刀豆蛋白凝集素A亲合层析柱制备向Poly-Prep层析柱内加入50μl刀豆蛋白凝集素A（Concanavalin A，ConA）琼脂糖，500μl0.01%Triton X-100的糖蛋白结合缓冲液Ⅰ洗1遍，再用最大量糖蛋白结合缓冲液Ⅰ洗2遍以备用。1.4N-连接糖蛋白提取血清20μl或100μg蛋白样品用糖蛋白结合缓冲液Ⅰ稀释为1ml后，加入ConA亲和层析柱中，4℃孵育过夜，500rpm离心后弃流出液，结合缓冲液Ⅰ洗10min，共4次，用200mM的甲基-α-D甘露糖苷洗脱液15min洗脱4次，再将洗脱液按1:4（V/V）加入-20℃丙酮，-20℃过夜，4000rpm离心60min，弃上清，室温干燥20min，加入40μl的2×Loading Buffer重悬蛋白。1.5Western blot检测ConA-CD/pCD表达20μg蛋白或纯化蛋白应用12%SDS-PAGE电泳分离后电转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭，抗CD/pCD抗体（1:5000）4℃过夜孵育，HRP标记二抗室温孵育1h，ECL检测目的条带，Quantity One进行蛋白条带的半定量分析。1.6CD/pCD沉默后的体外细胞浸润实验培养细胞至30-40%融合度时，用200nM CD siRNA和对照Scramble siRNA分别转染SNU473、SNU449细胞，24h后将2.5×104的转染细胞接种至侵袭小室中，于CO2培养箱37C孵育24h后结晶紫染色，在100×显微镜下随机选择5个视野计数发生转移细胞数。1.7统计学分析统计分析均采用SPSS17.0软件。数据表示为平均值±标准偏差（SD）。ROC曲线确定血清ConA-pCD在HCC诊断中的界值和曲线下面积（AUC），ANOVA分析血清ConA-pCD组间差异，各组间血清ConA-pCD含量和细胞体外转移实验比较采用t检验，P<0.05具有统计学意义。2结果2.1与正常肝组织、癌旁非癌肝组织相比，HCC组织中pCD表达均显著高表达（P<0.01），而CD成熟体则无明显改变；2.2CD主要表达于肝永生化细胞及癌细胞内，pCD主要表达于细胞分泌上清，pCD在肝癌细胞系（Huh7、PLC/PRF/5、SNU449、HepG-2、SNU473）中的表达明显高于肝永生化细胞（Chang Liver、L02），其中SNU449和SNU473分泌上清中pCD表达最高；2.3从慢性肝炎至肝硬化、HCC，血清中ConA-pCD表达逐渐增高，而在健康对照血清中表达量极低；HCC患者血清中ConA-pCD能够有效区分HCC及健康对照（AUC为1）HCC及慢性肝炎（AUC为1）、HCC及肝硬化（AUC为0.929）；2.4CD siRNA和对照Scramble siRNA转染SNU473、SNU449细胞72h后，CD/pCD表达明显受抑制，同时SNU449和SNU473的体外侵袭能力显著下降。3结论3.1HCC患者血清ConA-pCD可能来源于HCC细胞分泌，具有诊断HCC潜能，是一新型HCC血清标志物；3.2CD/pCD可能是HCC个体治疗及靶向治疗的分子靶点。