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我国棉花黄萎病主要病原为大丽轮枝菌(Verticillium dahliae),黄萎病的发生严重影响了棉花产量和品质,目前选育优异的抗病品种是防治黄萎病最为有效的措施。全基因组关联分析(GWAS)研究策略有利于充分利用自然群体中的历史重组事件,群体遗传变异丰富,对于抗性位点的定位具有更高的分辨率。陆地棉(Gossypium hirsutum)TM-1基因组测序工作的完成,为开展GWAS分析以及基因克隆提供了有力的支撑。本研究以299份优异棉花种质构建陆地棉抗黄萎病关联群体。SLAF测序得到覆盖26条染色体的85,630个高质量SNPs。群体内个体间亲缘关系评估显示群体含有丰富的遗传变异,个体间亲缘关系较远,对全基因组关联分析干扰较小。主成分分析和系统发育分析显示,群体主要可以分为2组,其中组I主要来自于长江流域棉区(YZR),组II主要来自黄河流域棉区(YR)和西北内陆棉区(NW),尽管在这两组内也发现不同程度的个体渗入,但是分组与个体的地理来源存在一定的相关性。基于不同环境下表型数据分别与基因型数据进行关联,共鉴定了17个与大丽轮枝菌响应显著相关的SNPs。A04,A02和D05等染色体上的峰值SNPs与已报道QTLs重叠,在A10染色体上关联得到一个在三种环境条件下稳定存在的抗性位点VwRL3。SNPs有效性分析显示,含有利SNP基因型的品种抗性明显较强,有利SNPs数量越多抗性越强,说明黄萎病抗性具有显著的聚合作用。单体型块图分析确定了一个372 kb的候选区间,该区间为一个抗病基因富集区,包含22个候选基因。分别对VwRL3位点内候选基因VIGS沉默分析显示只有GhTNL1基因单独沉默植株接菌后出现严重的黄萎病症状。抗、感材料中GhTNL1基因表达模式分析表明,该基因在大丽轮枝菌侵染后6-24 h表达强烈,这与大丽轮枝菌在6-24 h是侵染寄主的关键时期相吻合。拟南芥(Arabidopsis thaliana)接种大丽轮枝菌后表型鉴定显示,过表达株系(OE1)、异源回补株系(EC1)与野生型(Col-0)、突变体(tnl1)相比,植株叶片黄化、萎蔫等现象得到显著缓解,生长缓慢现象也得到部分恢复,说明GhTNL1基因能够提高拟南芥对大丽轮枝菌的抗性。分析发现GhTNL1基因含有典型的NB-ARC结构域和LRR重复基序,预测含有2个核定位信号,亚细胞定位显示2个核定位信号均具有定位活性。qRT-PCR分析表明GhTNL1基因通过茉莉酸途径行使其抗病功能。与Col-0及tnl1相比,OE1和EC1中ROS积累及抗病相关(PR)基因表达显著增加。抗、感不同材料中GhTNL1多态性分析显示在第225位处存在氨基酸G/R变异,该位点位于NB-ARC结构域P-loop保守基序内。为验证该变异位点作用,分别将GhTNL1~R(抗病基因型)和GhTNL1~S(感病基因型)在本氏烟(Nicotiana benthamiana)叶片中瞬时表达,发现GhTNL1~S诱导ROS积累和PR基因表达能力明显减弱。因此推测,该位点变异是导致棉花不同品种对黄萎病抗、感性的分化的原因之一。