口腔癌是口腔黏膜上皮来源的恶性肿瘤,其发生发展是一个多因素的复杂过程。目前,肿瘤的起源普遍认为是体内细胞的遗传物质发生突变引起的,并且所有细胞积累突变的概率是均等的。肿瘤干细胞假说的提出为肿瘤的来源带来了新的理解。肿瘤中存在一小群具有自我更新能力的细胞,这群细胞能够起始肿瘤,并维持肿瘤的生长和异质性,被称为肿瘤干细胞或者肿瘤起始细胞。由于肿瘤起始细胞和多能干细胞一样都能够进行自我更新和特异分化,因此有人认为肿瘤起始细胞和多能干细胞具有某种相似性。通过研究多能干细胞因子与口腔癌的发生发展关系,从而为进一步探讨口腔癌的起源提供可能。细胞重编程可以在一定条件下通过改变细胞基因表达程序的差异,使体细胞的遗传记忆被清除,重新程序化产生新的表型和功能,恢复细胞的多能性。体细胞在被外源性导入Oct4、Sox2、C-Myc和Klf4(OSCK)之后可以被重编程为诱导多能干细胞(i PSCs),这四种因子被称为多能干细胞因子,然而有人同样利用该四种重编程因子得到却是肿瘤的表型。由此可见,重编程i PSCs的过程和肿瘤产生的过程有着某种内在的联系。在OSCK这四种重编程因子中c-Myc作为原癌基因,本身可以引起p53介导的细胞凋亡和衰老,而Klf4抑制了p53的表达,从而中和了c-Myc的凋亡作用,因此重编程i PSCs的全能性是由Oct4和Sox2转染获得的。近来研究表明Oct4和Sox2基因的异常表达与肿瘤的发生发展有关,但细胞是否在Oct4和Sox2的作用下,发生了部分重编程导致肿瘤的发生,目前为止尚无明确结论。本课题将从以下四个部分通过实验研究分别探讨Oct4和Sox2在正常口腔黏膜和口腔癌的表达差异,以及对口腔上皮细胞和口腔癌细胞的致瘤作用,从而为今后口腔癌的防治提供新的思路。第一部分:Oct4和Sox2在口腔黏膜癌变过程中的表达情况目的:了解正常口腔黏膜、口腔癌前病变(或病损)以及口腔癌中Oct4和Sox2的表达情况。方法:利用4-硝基喹啉-1-氧化物诱导小鼠口腔黏膜上皮产生增生,建立类癌前病变的动物模型(20例),以及正常小鼠的口腔黏膜(20例)作为对照,同时在临床收集口腔白斑(20例)、口腔扁平苔癣(20例)以及口腔鳞状细胞癌(40例)的病理组织蜡块进行免疫组织化学染色分析,初步判断Oct4和Sox2在各组组织的表达情况。结果:HE染色显示小鼠癌前病变模型建立成功,在小鼠正常黏膜中Oct4和Sox2可单独出现,却不能同时表达在同一个样本;在小鼠的变异黏膜中Oct4和Sox2同时表达在同一个样本的情况占70%;在人口腔癌前病变(或病损)和口腔鳞状细胞癌中Oct4和Sox2同时表达在同一个样本的情况分别为62.5%和65%。第二部分:多能干细胞因子Oct4和Sox2重编程口腔黏膜上皮细胞成瘤目的:探讨Oct4和Sox2对永生化口腔上皮细胞h TERT+-OME的重编程致瘤作用。方法:制备慢病毒载体,分别将Oct4和Sox2转入h TERT+-OME细胞,筛选后进行细胞重编程。用重编程后的细胞在免疫缺陷小鼠(每组10只)体内进行异体移植瘤实验,观察各组小鼠的成瘤情况,并对所成肿瘤组织进行HE染色和免疫组织化学染色分析定性。结果:h TERT+-OME细胞经过Oct4和Sox2重编程过程,得到三组新细胞:h TERT+-O+-OME、h TERT+-S+-OME以及h TERT+-OS+-OME。仅h TERT+-OS+-OME细胞在小鼠皮下形成肿瘤,肿瘤平均质量=0.1249±0.0162g。HE染色显示:肿瘤有类腺管样特征,并且侵入了临近的骨骼肌组织。免疫组织化学实验表明:CK5、CK19,Vimentin、Ki67、Oct4和Sox2阳性;CD31和Calponin阴性。第三部分:多能干细胞因子Oct4和Sox2对口腔癌细胞成瘤作用的研究目的:进一步探讨Oct4和Sox2对口腔癌细胞的致瘤作用以及它们之间的相互关系。方法:建立人牙龈癌原代培养细胞系Gca1551,同时采用人舌鳞癌细胞系Cal27作为生物重复参考。构建慢病毒载体,利用sh-RNA技术分别干扰两个口腔癌细胞系中Oct4和Sox2的表达,流式细胞仪筛选后,建立6株新的细胞Gca1551-Olow,Gca1551-Slow,Gca1551-OlowSlow,Cal27-Olow,Cal27-Slow和Cal27-OlowSlow。Western blot检测各组细胞内Oct4和Sox2表达情况。各组细胞在免疫缺陷小鼠体内进行异体移植瘤实验,观察各组小鼠的成瘤情况,并对所成肿瘤组织进行HE染色分析。Western blot检测各组肿瘤组织中相关蛋白(Oct4,Sox2,Ki67,Snail和VEGF)的表达情况。结果:Oct4蛋白在所有Oct4low细胞中表达有所降低,在单独Sox2low的细胞中也有略微降低;Sox2蛋白在所有Sox2low细胞中表达降低,而在单独Oct4low细胞中表达有所上升。成瘤实验结果发现Sox2low和Oct4lowSox2low细胞所成肿瘤与对照组相比体积、质量、恶性程度以及相关因子的表达程度(Ki67,Snail和VEGF)均有所下降;而Oct4low细胞所成肿瘤的各项指标却略有上升。第四部分:多能干细胞因子Oct4和Sox2对口腔上皮细胞及口腔癌细胞致瘤作用机制的研究目的:探讨Oct4和Sox2对口腔上皮细胞和口腔癌细胞致瘤作用机制。方法:采用高通量测序的方法,检测8株细胞(h TERT+-OME、h TERT+-O+-OME、h TERT+-S+-OME、h TERT+-OS+-OME、Gca1551、Gca1551-Olow、Gca1551-Slow和Gca1551-OlowSlow)中lnc RNA以及所对应的m RNA的表达情况,再利用同源细胞在相同的遗传背景下,对比寻找转入和敲除Oct4和Sox2以后的共同差异m RNA,从而初步探明Oct4和Sox2对口腔肿瘤发生发展产生作用时所调控的靶基因。结果:经过对8组样本的测序、筛选,一共检测出3371个可供分析的转录本。对比双转和双敲Oct4和Sox2后的共同差异转录本为52条,其中对应的RHEBL1和RPS19差异较明显。经过RT-PCR验证RHEBL1和RPS19无论在双转了Oct4和Sox2的可致瘤口腔上皮细胞系中,还是在尚未敲除Oct4和Sox2的口腔癌细胞系中均出现了异常的高表达情况。结论:1、Oct4和Sox2能够在口腔癌前病变和癌组织中同时表达在同一个细胞,而在正常口腔黏膜组织中却不能同时表达。2、Oct4和Sox2能够重编程口腔上皮细胞h TERT+-OME为肿瘤细胞h TERT+-OS+-OME,并且在免疫缺陷小鼠体内成瘤。3、Oct4和Sox2在促进口腔肿瘤的发生、发展的过程中是一个相互作用、相互影响的有机体,其中Oct4是起始肿瘤的关键因子,Sox2是影响肿瘤性质的关键因子。4、Oct4和Sox2在口腔肿瘤发生、发展的过程中,可能是通过lnc RNA调控下游的RHEBL1和RPS19等m RNA从而发挥了促瘤作用。