背景:肠缺血再灌注损伤（intestinal ischemia reperfusion injury,IIRI）是一种广泛存在且严重危及生命的消化系统病理过程。肠（尤其小肠）作为体内对缺血再灌注损伤最为敏感的器官之一,其损伤可引发如腹膜炎、酸碱中毒,以及脓毒血症等系统性并发症,甚至导致休克和死亡。在我国,急性肠系膜缺血类病症即便及时治疗,死亡率仍高达50%～80%[1-3]。造成这种高死亡率的直接原因就是血流恢复后难以避免的再灌注损伤。由于IIRI的致病机理复杂,目前除对症治疗外尚缺乏十分有效的治疗手段和药物。众多在研的治疗方法中,抗氧自由基治疗被认为是最具有应用前景的策略之一[4-5]。因此,寻求更优秀的抗氧自由基药物,并通过对药物作用机制的阐明发现新的作用靶点和治疗策略,一直以来都是IIRI研究的重点和热点。芹菜素-7-O-β-D-（-6’’-p-香豆酰基）-吡喃葡萄糖苷（apigenin-7-O-β-D-（-6’’-p-coumaroyl）-glucopyranoside,APG）是从经典藏药甘青铁线莲中分离得到的一种新型黄酮苷类化合物,既往研究中显示出良好的抗氧化作用[6-8]。然而,APG对IIRI的药效作用尚不清楚,其主要的作用机制仍需进一步的研究阐明。目的:本研究旨在通过小鼠IIRI和细胞OGD/R模型,从组织、细胞和分子水平主要达成以下研究目的:1.药效的确证:系统确证APG减轻IIRI,保护肠组织的作用。2.机制的阐明:阐明APG通过抑制内皮细胞破坏,维持肠道微循环功能,减轻组织损伤的具体机制。3.靶点的揭示:确证APG发挥减轻IIRI的主要作用靶点,揭示药物与靶点的作用方式。方法:1.建立小鼠IIRI模型,从肠组织、肠血管、血管内皮三个层面综合评价APG减轻IIRI的作用通过夹闭肠系膜上动脉45 min后恢复血流90 min的方法建立C57BL/6J小鼠（8-10周龄,20-25g,雄性）IIRI模型,并在夹闭动脉15 min后采用腹腔注射的方式给予不同剂量的APG（低剂量2mg/kg,中剂量4 mg/kg,高剂量8mg/kg）。通过大体观测、H＆E染色和Chiu’s评分评价药物干预后肠组织的损伤情况（Chiu’s评分越高证明损伤越严重）;检测血清中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）水平评价药物干预后肠损伤引发的氧化应激水平变化情况;借助微循环监测系统评价再灌注后肠系膜血液微循环功能,采用伊文思蓝染色法评价肠血管通透性改变,采用免疫组化、H＆E染色方法评价肠血管的损伤情况;通过检测内皮损伤标志物内皮素（ET）、凝血酶调节蛋白（TM）确证APG对再灌注后血管内皮损伤的保护作用。同时,建立不同剂量APG（低剂量0.5μM,中剂量1μM,高剂量2μM）预处理12h后的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）氧糖剥脱/复氧复糖模型（OGD/R,氧糖剥脱70 min,复氧糖4h,下同）,体外模拟内皮细胞再灌注损伤过程,并通过内皮细胞黏附性实验评价APG对内皮细胞的保护作用。综合以上结果,从肠、血管到内皮细胞三个层面评价APG的抗IIRI作用。2.构建药物＆疾病靶点库,借助网络药理学手段,筛选并阐明APG的主要作用机制以APG的核心药效基团为对象,在TCMSP、Pharmmapper数据库中搜索并建立对应的药物靶点库;以IIRI为关键词,在Gene Cards数据库中搜索建立疾病靶点库,两库取交集后获得药物＆疾病靶点库,结合文献报道进一步扩充后初步筛选出APG抗IIRI作用的潜在靶点,并对靶点进行GO和KEGG富集分析,找到可能的作用机制并进行验证。使用不同剂量APG（低剂量0.5μM,中剂量1μM,高剂量2μM）预处理12h后的HUVEC建立OGD/R模型和Erastin（铁死亡诱导剂,10μM,预处理细胞6h）诱导模型,采用JC-1染色法检测细胞线粒体膜电位变化,透射电镜观测线粒体的形态学变化,评价内皮细胞中的线粒体损伤情况;采用DHE染色评价胞内的ROS水平,C11-BODIPY 581/591探针检测细胞中脂质过氧化水平;采用Fe Rho Nox-1荧光探针检测细胞内Fe2+的变化水平;采用Western Blot法检测铁死亡相关蛋白ACSL4、PTGS2、NOX-1、FTH1、GPX4表达水平,综合以上指标确证APG抑制内皮细胞铁死亡、减轻IIRI的作用机制。3.采用虚拟对接、亲和力测定和基因干预相结合的手段,分析并确证APG的主要作用靶点针对网络药理学筛选出的APG潜在作用靶点,分别建立靶点蛋白空间结构模型和APG分子空间结构模型,采用分子虚拟对接与微量热泳动（MST）亲和力测定相结合的方式,初步确定与APG具有较好空间结合性和亲和力的蛋白分子,并以此作为APG抗IIRI作用的潜在靶点进行实验验证。建立HUVEC的OGD/R和Erastin诱导模型,对比APG（2μM）、靶点siRNA干扰,以及APG+siRNA作用下的HUVEC损伤和铁死亡相关指标的变化情况。进一步的,建立小鼠IIRI模型,再次对比APG（8mg/kg）、潜在靶点抑制剂（10 mg/kg Zn PPIX,10mg/kg Selegiline）处理后小鼠肠、血管和内皮的损伤情况,确证APG保护血管内皮、减轻肠组织损伤的作用靶点。结果:1.APG具有显著的抗IIRI作用,可剂量依赖性的减轻再灌注后小肠、小肠微循环,以及血管内皮的损伤（1）APG具有良好的减轻IIRI的作用。大体观察显示,IIRI组小鼠小肠组织明显出现水肿、颜色发红变暗,甚至变黑坏死的情况,而APG可显著缓解此种损伤,以高剂量组治疗作用最为明显。肠组织Chiu’s评分显示,IIRI后评分明显增高,而APG组评分显著低于IIRI组,且随着APG的剂量增加Chiu’s评分逐步减少,高剂量组Chiu’s评分已降至IIRI组的32.07%。H＆E染色显示,APG可显著减轻肠绒毛破裂、脱落和炎性细胞浸润的情况。氧化应激水平检测显示,IIRI组血清中氧化应激水平明显增加,其氧化性因子MDA水平是Sham组的3.74倍,抗氧化因子SOD下降为Sham组的49.48%,而APG以剂量依赖性方式抑制IR引起的MDA水平增加和SOD水平减少,其中APG高剂量的MDA水平是IIRI组的39.05%,SOD水平是IIRI组的1.74倍。（2）APG可减轻IIRI后肠微循环障碍。肠血管渗透性实验（伊文思蓝染色）显示,APG治疗后肠组织中伊文思蓝渗出明显减少（P＜0.01）,其中高剂量组肠组织中的染料含量已降至对照组的1.62倍（P＜0.01）,显著低于IIRI组的6.87倍。微循环观测显示,IIRI后肠系膜上动脉中血流缓慢,出现湍流、涡流和钟摆流,并随着再灌注时间的延长逐步出现内皮脱落,附壁血栓积聚阻塞血管的情况,而APG可以显著的改善微循环功能障碍这一状况。免疫组化染色显示,APG干预组的小鼠小肠绒毛微血管形态学较为完整,尤其是高剂量组未出现明显的微血管损伤断裂的情况。（3）APG可减轻IR后小肠血管内皮损伤。肠系膜上动脉H＆E染色表明APG可以保护IR后血管内皮细胞的破坏和丢失。内皮损伤标志物也证实了以上观测结果,IIRI组血清中的ET-1、TM含量较Sham组显著增加,进行不同剂量APG干预后ET-1的含量降至IIRI组的46.56-71.43%,TM的含量降至IIRI组的59.52-94.75%。体外实验也证实,APG可以显著改善OGD/R后HUVEC皱缩、破损,减少从培养皿脱落细胞的数量,从残存细胞结晶紫染色来看OGD/R组的OD值仅是Control组的26.79%,而APG干预组则是Control组的49.29-73.06%。2.APG可通过抑制OGD/R引发的内皮细胞脂质过氧化和Fe2+过载,缓解线粒体损伤,逆转铁死亡相关蛋白的改变,阻断铁死亡过程,减轻再灌注损伤（1）APG干预IIRI过程与铁死亡高度相关。通过APG结构解析,以“芹菜素”、“香豆素”和“葡萄糖”为药效基团搜索药物作用靶点,获得靶点144个;通过Gene Card数据库和文献报道建立IIRI疾病靶点库,获得靶点1567个,两库取交集后“药物＆疾病共有靶点”64个。64个共同靶点的GO富集分析表明APG对IIRI的影响与铁离子稳态、铁蛋白复合物和线粒体高度相关。综合以上结果,APG的抗IIRI作用与内皮细胞铁死亡高度相关。（2）APG可阻断OGD/R诱导的铁死亡过程。透射电镜和JC-1染色显示,OGD/R后细胞线粒体萎缩,嵴减少或消失,膜密度增加,线粒体膜电位降低,APG能够逆转这一过程,显示出良好的线粒体保护作用;Fe Rho Nox-1荧光探针染色显示,所有剂量下APG均可抑制OGD/R后HUVEC中Fe2+的堆积,其高剂量组（2μM）抑制效果与Lip-1（铁死亡抑制剂Liproxstatin-1,1μM）接近;DHE染色显示,APG显著降低OGD/R后HUVEC中的ROS水平,在预孵2μM APG后DHE荧光强度与IIRI组相比降低了87.39%（P＜0.01）;C11-BODIPY 581/591探针实验显示,APG显著降低OGD/R诱导的脂质ROS的产生,其高剂量组（2μM）与阳性对照药Lip-1均可以将脂质过氧化水平降至OGD/R组的10%以下;WB实验结果显示,APG以剂量依赖性方式逆转铁死亡相关蛋白ACSL4、PTGS2、NOX-1表达增加,抑制FTH1、GPX4的表达减少,其作用效果与Lip-1相当。3.APG与HO-1、MAO-B具有良好的亲和力,可通过抑制再灌注诱导的HO-1和MAO-B的过度激活,阻断内皮细胞铁死亡,减轻IIRI（1）APG与HO-1、MAO-B具有良好的亲和力。分子虚拟对接实验显示,在药物＆疾病的64个共同靶点中,仅有14个与APG具有良好的空间结合性（-CDocker Energy＞0）。根据-CDocker Energy排名前两位的是HO-1和MAO-B。MST结果证实,APG与HO-1结合的kd值为3.1μM,APG与MAO-B结合的kd值为2.8μM,APG与HO-1、MAO-B结合效果良好。（2）APG可显著抑制OGD/R诱导的HO-1、MAO-B过度激活。酶活性检测实验表明,OGD/R后HO-1酶活性较Control组增加了约2.54倍,MAO-B增加了3.45倍;APG（2μM）对正常HUVEC中的HO-1和MAO-B酶活性有轻微的抑制作用,酶活性分别降至Control组的79.00%（HO-1）和83.00%（MAO-B）,而对OGD/R刺激后的HUVEC中的HO-1和MAO-B的酶活性具有明显的抑制作用,以高剂量组（2μM）的抑制效果最为明显,高剂量组HO-1活性是OGD/R组的56.30%,MAO-B活性是OGD/R组的36.94%。WB和q PCR实验发现,APG也可抑制OGD/R引起的m RNA和蛋白质表达水平增加,其不同剂量下HO-1 m RNA水平是OGD/R组的56.56%-82.24%,HO-1蛋白水平是OGD/R组的28.28%-81.38%;不同剂量APG干预组的MAO-B m RNA水平是OGD/R组的34.66%-64.14%,MAO-B蛋白水平是OGD/R组的32.71%-74.04%。（3）APG可抑制Erastin诱导的内皮细胞铁死亡。在使用Erastin诱导的HUVEC铁死亡实验中,细胞线粒体在Erastin处理后明显出现损伤,JC-1染料非聚集态/聚集态较Control组增加了83.88倍,而在使用DFO（100μM,下同）、APG（2μM）,以及siRNA抑制HO-1和MAO-B表达水平后均可以稳定线粒体膜电位,减轻Erastin造成的线粒体损伤;胞内Fe2+水平在Erastin处理后较Control组增加了13.99倍,而使用APG、DFO,联合使用siRNA HO-1和siRNA MAO-B,以及siRNA+APG（2μM,下同）后分别降低至OGD/R组的24.66%、34.77%、28.22%和33.63%;脂质过氧化水平在Erastin处理后较Control组增加了2.67倍,而使用DFO、APG、联合使用siRNA,以及siRNA+APG后抑制率分别达到了59.77%、58.78%、52.02%和58.57%。同时,APG、DFO、联合使用siRNA,以及siRNA+APG均抑制铁死亡引发的ACSL4、PTGS2、NOX-1表达水平增加和FTH1、GPX4表达水平减少。与DFO组相比,siRNA组和siRNA+APG组表现出更为良好的抗铁死亡作用,但siRNA+APG组与siRNA组各指标无显著差异。（4）联合抑制HO-1和MAO-B具有良好的减轻IIRI作用。体内实验证明,再灌注前分别或联合给予Zn PPIX和Selegiline（10 mg/kg,下同）处理与APG（8mg/kg,下同）具有类似的减轻IIRI作用。其中,单独使用Zn PPIX和Selegiline的组织保护效果不及APG,但两种抑制剂联合使用（10 mg/kg Zn PPIX+10 mg/kg Selegiline,下同）的效果与APG效果相似,抑制剂和APG三药联合使用的效果最佳。各组Chiu’s评分分别是IIRI的32.14%（APG）、92.84%（Zn PPIX）、71.42%（Selegiline）、25.01%（Zn PPIX+Selegiline）和25.00%（APG+Zn PPIX+Selegiline）,以APG组、Zn PPIX+Selegiline和APG+Zn PPIX+Selegiline组评分最低,肠保护效果最好。在微循环保护方面,APG、Zn PPIX、Selegiline、Zn PPIX+Selegiline,以及APG+Zn PPIX+Selegiline的血流状态评分分别是IIRI组的52.63%、65.80%、76.31%、47.37%和42.11%,以APG+Zn PPIX+Selegiline和Zn PPIX+Selegiline对微循环的保护效果最优,其次是APG干预组。H＆E染色也显示药物干预后血管内皮皱缩、脱落现象减少。同样,在给予药物干预后也可以抑制血清中的氧化应激水平,其中以APG、Zn PPIX+Selegiline、APG+Zn PPIX+Selegiline效果最好,其SOD水平分别是IIRI组的1.74倍、1.82倍、1.76倍,MDA水平分别是IIRI组的39.05%、33.99%、32.77%。结论:天然来源的小分子化合物APG可通过减轻肠血管内皮损伤,改善肠道微循环功能,发挥显著的抗肠缺血再灌注损伤作用;APG的抗IIRI作用可通过抑制内皮细胞中脂质氧自由基的过度产生和Fe2+异常堆积,稳定线粒体膜电位,阻断内皮细胞铁死亡实现;APG与HO-1和MAO-B具有良好亲和力,APG的抗铁死亡作用主要是通过抑制两酶活性实现的。APG可作为抗肠缺血再灌注损伤的潜在新药物,其作用机制的阐明和作用靶点的揭示为肠缺血再灌注损伤相关疾病的预防和治疗提供了新策略。