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肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我国最常见恶性肿瘤之一。肿瘤细胞侵袭和转移是成功治疗HCC的最大障碍,也是造成癌症患者死亡的主要原因。目前肝细胞癌的侵袭和转移机制还不很清楚,因此探索肿瘤侵袭和转移的机制、寻找抑制肿瘤侵袭和转移的有效靶点,一直是国内外研究的热点。ASAP3 (ARF-GAP containing SH3,ANK repeats and PH dommn 3),又名UPLCl. ACAP4.DDEFLl,是ARF(ADP ribosylation factor)-GAPs(GTPase Activiting Protein)家族的一个新发现的成员。与该家族的大部分成员一样,该蛋白具有BAR、PH、GAP和ANK等多个结构域,可能在细胞内囊泡运输、细胞骨架组装、细胞生长、细胞迁移等方面发挥着重要的作用。研究表明,ASAP3在人肝细胞癌中超量表达。本课题通过ASAP3特异性siRNA和ASAP3真核表达载体分别在高转移性和低转移性的HCC细胞株(MHCC97H和Hep3B)中抑制和增强ASAP3的表达,探讨ASAP3基因表达与HCC肿瘤细胞增殖、凋亡和侵袭转移之间的关系,旨在为其临床应用研究提供理论基础和实验依据,并为以此为靶点进行HCC防治研究提供新策略。目的：构建ASAP3-siRNA表达载体和ASAP3真核表达载体并将之转染入侵袭转移潜力不同的肝癌细胞中以获得ASAP3基因“沉默”和“增强”的HCC细胞,在此基础上,揭示ASAP3与肝癌细胞侵袭转移潜能之间的关系,为肝癌的基因治疗提供新的靶点和实验资料。方法：(1)利用生物信息学技术在线设计特异性ASAP3和GAPDH-siRNA,在体外构建和克隆ASAP3和GAPDH-siRNA表达载体(pASAP3-siRNA和pGAPDH-siRNA)；(2)将ASAP3-siRNA表达载体及pGAPDH-siRNA分别瞬时转染MHCC97H肝癌细胞中,以未转染细胞作为阴性对照；RT-PCR法检测肝癌细胞株MHCC97H细胞ASAP3 mRNA表达水平,Western印迹法检测肝癌细胞株MHCC97H细胞ASAP3蛋白表达强度,鉴定ASAP3-siRNA表达载体的功能；MTT法检测细胞增殖和粘附率,流式细胞术检测细胞凋亡,细胞划痕法检测细胞迁移能力,Transwell小室法检测细胞侵袭性；(3)构建和克隆ASAP3真核表达载体(pASAP3); (4)将pASAP3真核表达载体瞬时转染Hep3B肝癌细胞中；RT-PCR法检测肝癌细胞株Hep3B细胞ASAP3 mRNA表达水平,Western-Blot法检测Hep3B细胞中ASAP3蛋白的表达水平,鉴定pASAP3真核表达载体的功能；MTT法检测细胞增殖和粘附率,流式细胞术检测细胞凋亡,细胞划痕法检测细胞迁移能力,Transwell小室法检测细胞侵袭性。主要结果：(1)构建的pASAP3-siRNA表达载体对MHCC97H表达ASAP3 mRNA的沉默效率约为67%,对ASAP3蛋白表达的抑制率也超过65%,对细胞增殖的抑制率为42.03±4.36%。(2)pASAP3-siRNA转染MHCC97H细胞48h后,凋亡率为13.88±1.74%,而在其他对照组中并无明显凋亡出现；细胞接种60min后,pASAP3-siRNA转染MHCC97H细胞的粘附率明显降低,为26.89±6.39%,和其他对照组比较具有显著性差异(P<0.05)；转染24h后,ASAP3-siRNA转染细胞的划痕愈合较慢(37.67±10.04%),pASAP3-siRNA转染MHCC97H细胞的侵袭力下降,较前两组明显降低(P<0.01)。(3)pASAP3真核表达载体对Hep3B表达ASAP3 mRNA的增加效率约为3倍,对ASAP3蛋白表达的增加率也接近2倍。(4)pASAP3转染Hep3B细胞48h后,对细胞增殖的增加率为31.23±10.14%；细胞接种60min后,pASAP3转染Hep3B细胞的粘附率明显提高,为42.75±9.36%,和其他对照组比较具有显著性差异(P<0.01)转染24h后,pASAP3转染细胞的创口愈合较快(16.37±5.28%)和其他对照组比较具有显著性差异(P<0.05)；pASAP3转染Hep3B细胞的侵袭力增强,较对照组明显增高(P<0.01)。结论：(1)ASAP3-siRNA真核表达载体转染MHCC97H细胞中可有效降低ASAP3的mRNA和蛋白的表达水平：ASAP3-siRNA对MHCC97H细胞的增殖能力有抑制作用；可诱导MHCC97H细胞凋亡；还可明显抑制其在细胞外基质上的粘附率、向划痕损伤区的迁移能力和体外侵袭能力；(2)ASAP3真核表达载体转染Hep3B细胞中可有效增加ASAP3的mRNA和蛋白的表达水平；pASAP3增强Hep3B细胞的增殖能力；还可明显增强其在细胞外基质上的粘附率、向划痕损伤区的迁移能力和体外侵袭能力。本研究揭示,ASAP3可增强肝癌细胞的侵袭转移潜能。后续工作拟在此基础上,继续研究ASAP3对HCC细胞作用的分子机制,找寻以ASAP3作为基因干预的靶点,对发现肝癌治疗新策略、防止肝癌转移和复发具有一定的临床意义。