TNFα引起肝肾综合征肾小球滤过率下降的机制研究目的肝肾综合征（HRS）的主要发病机制是肾小球滤过率（GFR）明显下降。已知肾小球系膜细胞（GMCs）收缩可引起肾小球滤过面积减少。HRS患者血中肿瘤坏死因子α（TNFα）水平异常升高，TNFα是否参与了GMCs收缩引起的GFR下降尚不清楚。胞浆游离Ca²⁺浓度([Ca²⁺]i)升高与GMCs收缩密切相关。1，4，5-三磷酸肌醇受体（IP₃Rs）是细胞内重要的Ca²⁺释放通道。因此GMCs中IP₃Rs表达的多少与其对缩血管物质的敏感性有着密切联系。本研究用TNFα处理原代培养的GMCs，检测其对胞浆Ca²⁺浓度、细胞收缩程度、IP₃RI蛋白、IP₃RI mRNA表达水平及IP₃RI启动子活性的影响，探讨TNFα在其中的作用；同时探究TNFα对PKCα活性的影响，以及PKCα在TNFα-IP₃RI mRNA表达增加中的信号转导作用，为HRS时GFR下降的发生机制提供理论依据。材料与方法1、材料选择雄性Wistar大鼠，原代分离大鼠肾小球系膜细胞，并置于10％FCSDMEM培养液，37℃CO₂培养箱中培养，原代培养2周后常规传代，经倒置显微镜形态学鉴定及免疫荧光抗α-肌动蛋白抗体染色阳性、抗角蛋白抗体染色阴性鉴定为系膜细胞，取3-8代细胞用于实验。2、方法（1）分组：分组1：TNFα处理0h、2h、4h、8h、24h组；分组2：对照组（D组）、TNFα处理8h组（T组）、L-苏式二氢神鞘氨醇（safingol）处理8h组（S组）、TNFα与safingol共处理8h组（TS组）。每组设2个样本，并用不同代细胞重复4次。（2）应用Fluo-3／AM荧光标记技术及共聚焦显微镜检测单个细胞内Ca²⁺浓度动态变化，观察TNFα对胞内Ca²⁺浓度的影响。（3）通过对收缩前、后的GMCs表面积进行测量得出细胞收缩的幅度，借以探讨TNFα对GMCs收缩敏感性的影响。（4）应用免疫细胞化学、Western blot、Real-time PCR方法检测TNFα对GMCs中I型IP₃R蛋白及其mRNA表达的影响。（5）将重组质粒PGL_3- IP₃R₁promoter转染GMCs，通过检测萤火虫荧光素酶（luc）报告基因的表达活性，说明TNFα对IP₃RI启动子活性的影响。（6）应用免疫荧光、体外磷酸化、Western blot方法研究TNFα对PKCα活性及PKCα蛋白表达的影响。（7）用Real-time PCR方法检测抑制PKCα活性对TNFα上调IP₃RI mRNA表达的影响。结果1、[Ca²⁺]i测量结果Fluo-3／AM标记后显示，内皮素（ET）刺激可使GMCs胞内钙离子浓度在短时间内有个迅速、显著的增加。TNFα孵育4h、24h组上述效应明显增强，两组[Ca²⁺]i上升幅度与对照组相比均有显著性差异（p<0.05），但TNFα处理4h与24h无显著差异（p>0.05）。上述效应可被2-氨基乙基二苯硼酸盐（2-APB）完全阻断。2、GMCs表面积测量结果对照组加入ET约1min时，即出现可见的细胞收缩变化；4min时细胞形态变化最为明显，细胞面积明显缩小。TNFα孵育4h、24h组上述效应明显增强，细胞面积缩小的更加明显，以24h组为著，两组与对照组相比差异显著（p<0.01）。3、免疫细胞化学检测Ⅰ型IP3R结果Ⅰ型IP₃R主要分布于GMCs的胞浆内，以靠细胞核附近的胞浆分布较为集中，在对照组表达水平较低。TNFα孵育4h-24h组均可发现棕褐色阳性信号增强，阳性细胞百分比增加，以24h时最为明显，各组与对照组比较差异显著（p<0.05）。4、Western blot定量分析Ⅰ型IP₃R表达对照组Ⅰ型IP3R表达水平较低；TNFα处理4h-24h组与对照组相比Ⅰ型IP₃R蛋白的表达明显增高，以24h最为明显，与对照组比较有显著差异（P<0.05）。5、实时定量PCR检测Ⅰ型IP₃RmRNA表达TNFα处理2h-24h组与对照组相比，Ⅰ型IP₃RmRNA的表达增高，以TNFα处理8h时最为明显，差异显著（P<0.05）。6、IP₃RI启动子活性检测在对照组GMCs内，Ⅰ型IPⅠ₃R启动子活性很弱；TNFα处理4h-24h组，Ⅰ型IP₃R启动子活性增强，以TNFα处理8h最为明显，与对照组相比有显著性差异（P<0.05）。7、免疫荧光检测PKCα的分布对照组PKCα定位于胞浆内，呈散在分布；TNFα处理8h-24h组，PKCα转位于核周分布且部分转位于核内分布。8、免疫沉淀后PKCα活性检测对照组即存在相当活性的PKCα；TNFα处理8h-24h组PKCα活性明显增强，以TNFa处理8h最为显著（P<0.05）。9、Western blot定量分析PKCα蛋白表达GMCs中PKCα蛋白呈高水平表达，但PKCα蛋白的表达在TNFα处理各组与对照组间无显著差异（p>0.05）。10、Real-time PCR方法分析PKCα抑制剂对TNFα上调Ⅰ型IP₃RmRNA表达的影响T组Ⅰ型IP₃RmRNA呈高水平表达；TS组与T组相比，Ⅰ型IP₃R mRNA的表达明显下降，差异显著（P<0.05）。结论1、TNFα可增加ET刺激引起的胞内钙离子浓度。2、TNFα增加ET刺激引起的胞内钙离子浓度是通过IP₃Rs来产生效应的。3、TNFα对ET引起的GMCs收缩起着协同作用。4、TNFα处理的GMCs中，IP₃RI蛋白的表达及IP₃RI mRNA的表达明显增强，而且IP₃RI mRNA表达的上调在时相上先于IP₃RI蛋白的上调，说明TNFα可在IP₃RI mRNA的转录水平上进行调控。5、TNFα处理的GMCs中，Ⅰ型IP₃R启动子活性明显增强，说明其可通过增强Ⅰ型IP₃R启动子活性来诱导转录Ⅰ型IP₃RmRNA。6、TNFα处理的GMCs中，PKCα存在明显激活现象。7、应用PKCα抑制剂后，TNFα增强Ⅰ型IP₃R mRNA表达的作用被明显阻断，揭示了PKCα是TNFα-IP₃RImRNA表达通路的重要信使。