研究背景和目的脑血管疾病是世界最常见的疾病之一,因其发病率高、致残率高、死亡率高的特点,严重威胁人类生命与健康。缺血性脑血管病(ischemic cerebrovascular disease, ICVD)指供应大脑血流的主要动脉发生狭窄或闭塞,结果导致脑组织(特别是大脑中动脉区域)急剧缺血缺氧,最终引起局部脑组织发生缺血或坏死,出现相应的临床症状。缺血性脑卒中后可通过溶解血栓或机械再通的方式恢复缺血区的血液灌注,但一些病人在缺血后再灌注后不仅没有使组织功能恢复,反而使缺血所致的功能障碍和结构破坏进一步加重,即我们所说的脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion (IR) injury)。脑缺血再灌注损伤是一个复杂的病理生理过程,近来研究发现,脑血流中断和再灌注使脑的细胞产生损伤是一个快速的级联反应,这个级联反应包括许多环节,如能量障碍、细胞酸中毒、兴奋性氨基酸释放增加、细胞内钙失稳态、自由基生成、凋亡基因激活等。这些环节互为因果,彼此重叠,并相互联系,形成恶性循环,最终导致细胞凋亡或坏死。目前虽然对脑缺血的病理生理机制研究取得重大进展,但治疗选择仍然有限。一种成功抢救缺血组织的治疗方式是恢复再灌注,溶解血栓的重组组织型纤溶酶原激活剂型(recombinant tissue plasminogen activator, rt-PA)是唯一批准临床使用的药物,然而其时间窗有限(3h-4.5h),且造成出血并加重缺血再灌注损伤的风险。另一种方法则是以缺血级联反应中的各个关键环节为靶点,阻断其发展,达到神经保护的目的。遗憾的是虽然目前许多神经保护剂在动物实验上能缩小脑梗塞体积并改善神经功能,但没有一种被证实临床有效。天然存在的抗氧化物质所具有的神经保护作用近来成为人们关注的焦点。芒果苷(mangineferin, MAG)是一种天然的多酚类物质,广泛存在于许多药材如百合科植物知母以及芒果叶中。芒果苷分子中的四个芳香族羟基使其具有较强的抗辐射以及抗氧化作用。大量已发表的体内及体外研究表明芒果苷在炎症、氧化应激、肿瘤生长、微生物感染、代谢调节、免疫调节以及辐射保护方面具有广泛的药理学活性。本研究通过在整体动物水平和细胞水平上来建立神经元缺血再灌注损伤模型,探讨芒果苷对缺血性脑损伤的保护作用及其可能的机制,从而为芒果苷更安全、合理的应用于临床提供理论依据。研究方法在整体动物实验中,(1)采用线栓法阻塞大鼠中动脉(middle cerebral artery occlusion, MCAO),建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型,观察MAG对脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能评分,评价造模是否成功。大鼠脑缺血2h,再灌注24h后,观察存活大鼠行为变化,参考Zea-longa的5分制评分标准进行神经行为学评分。在剂量研究中,将大鼠随机分成6组：模型组、假手术组、阳性对照组(edaravone, Eda)、MAG各剂量组(5mg/kg、10mg/kg,20mg/kg)。假手术组除不插线外,其余步骤同上。假手术组与模型组均给予等体积生理盐水。HE染色观察组织形态学改变,观察MAG对大鼠缺血大脑的梗塞面积及含水量的影响；(2)较长周期给药实验中,将大鼠随机分成6组：模型组、假手术组、阳性对照组、MAG的高、中、低各剂量组,造模成功后分别于第2、4、6、8d,称量体重,采用姿势反射试验、肢体不对称试验两种方法作为行为学评价指标,观察MAG对大鼠缺血再灌注损伤后运动功能康复的影响；(3)氧化应激生化指标的检测：实验大鼠分组同上。脑缺血2h,再灌注24h后,比色法检测MAG对脑组织匀浆中丙二醛(malonaldehyde, MDA),还原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性的影响；(4)炎症生化指标的检测：实验大鼠分组同上。RT-PCR检测MAG对脑组织匀浆中炎性因子肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白介素-1β(Interleukin-1β, IL-1β)在转录水平表达的影响,随后实验采用ELISA法对上述两种炎性因子在蛋白质水平加以测定；(5)体外培养PC12细胞,应用化学方法建立细胞氧糖剥夺(oxygen-glucose deprivation, OGD)损伤模型,观察细胞形态学改变,并且应用四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)法观察不同浓度MAG对PC12细胞活力的影响,测定细胞外液乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase, LDH)浓度。研究结果1.MAG对大鼠脑缺血再灌注损伤神经行为学的影响假手术组大鼠均无异常症状,行为评分为0；模型组动物出现不能完全伸展对侧前爪,或向对侧转圈或向对侧倾倒等的神经损伤症状,其行为学评分与假手术模型组有显著性差异(P=0.000)。芒果苷中剂量组、高剂量组与模型组相比可显著降低行为学评分(P=0.023,P=0.030)。阳性对照组与模型组比较,行为学评分显著改善(P=0.020)。而芒果苷低剂量组与模型组相比无显著差异(P=0.818)。2.MAG对大鼠脑缺血再灌注损伤大脑组织病理学的影响组织形态学结果显示：假手术组的大鼠脑组织细胞形态规则,连接紧密。模型组的大鼠细胞周围间隙增宽,神经细胞大小不等,毛细血管萎缩,神经细胞肿胀,排列紊乱,细胞核呈深染固缩,部分胞质自溶,周围出现较大空泡,缺血脑组织形态改变严重。各给药组的大鼠均可见神经细胞缺血性改变减轻,细胞轻度肿胀,间质较致密,坏死细胞数量减少。其中MAG高剂量组可见神经细胞缺血性改变明显减轻,血管周围间隙和神经细胞周围间隙增宽明显减轻,优于模型组,坏死细胞数量明显减少。3.MAG对大鼠脑缺血再灌注损伤脑梗塞体积及水肿的影响图像分析行MCAO术后的大鼠脑冠切面,与假手术组相比,经TTC染色后可见明显且可重复出现的脑梗塞。假手术组的脑组织无梗塞。芒果苷低剂量处理组与模型组比较,无显著性差异(P=0.093),芒果苷中、高剂量组均可显著缩小缺血侧脑组织梗塞体积(P=0.001,P=0.000)。阳性对照组与模型组比较,脑梗塞体积显著降低(P=0.001)。与假手术组比较(62.46±0.63%),脑缺血所致的脑含水量显著增高(65.81±1.81%)说明了脑水肿的存在,模型组的脑组织含水量显著高于假手术组(P=0.000)；与模型组相比,芒果苷低、中、高剂量组(5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg)脑组织含水量显著降低(P=0.006,P=0.000,P=0.000)。阳性对照组脑组织含水量显著降低(P=0.000),与模型组相比有统计学意义。4.MAG对大鼠较长时间给药后体重及神经功能恢复的影响①体重变化率：所有大鼠除假手术组外术后均体重下降。模型组由于缺血再灌注引起的损伤,造成体重呈下降趋势。比较MCAO术后2、4、6、8d各组间体重变化率的差异,结果显示与假手术组同时间点(1.49±8.70,4.61±7.55,7.54±6.83,11.65±6.99)比较,模型组MCAO术后第2d、4d、6d和8d体重变化率显著降低(-10.36±2.55,-13.33±±6.05,-12.97±±7.61,-12.39±8.23),有显著性差异(P均<0.01)。与模型组比较,MAG高剂量组(20mg/kg)在造模后4、6d时可显著改善缺血再灌注引起的体重下降(-5.34±10.30,-5.06±8.34),有显著性差异(P均<0.05)。MAG低、中剂量组(5、10mg/kg)及阳性对照组(6mg/kg)给药后可改善缺血再灌注引起的体重下降,但无统计学差异(P均>0.05)。②姿势反射试验：假手术组大鼠肢体功能正常,评分为O。MCAO术后第2d、4d、6d和8d各时间点与假手术组(0±0)比较,模型组有显著性增加(1.90±0.13,1.71±0.32,1.74±0.22,1.41±0.43),具有显著性差异(P--0.000)。与模型组比较,芒果苷低剂量组(5mg/kg)各时间点均无显著性差异(P均>0.05)外,中、高剂量组(10.20mg/kg)各时间点大鼠姿势反射测量值均显著下降(P均<0.01)；与模型组比较,阳性对照组仅在2、6d两个测量时间点对大鼠脑缺血引起的运动障碍有显著的改善作用(P=0.000,P=0.000)。③肢体不对称试验：与假手术组(18.08±17.50,0±23.98,5±27.76,13.46±21.25)比较,造模后第2d、4d、6d和8d各时间点模型组前肢不对称应用评分均显著升高(68.89±21.33,52.78±33.36,48.89±35.16,52.78±30.01),具有显著性差异(P=0.000)。比较MCAO术后2、4、6、8d时各组间肢体不对称评分的差异,结果显示与模型组比较,仅MAG高剂量(20mg/kg)在各个时间点均有显著下降(P均<0.01)；芒果苷低、中剂量组(5、10mg/kg)和阳性对照组(6mg/kg)虽然在MCAO术后能改善在各个时间点的肢体不对称评分,但只有第2d和第8d有显著意义(P均<0.01)。5.MAG对缺血再灌注大鼠脑SOD、GSH和MDA水平的影响模型组脑缺血半球SOD活力显著低于假手术组(P=0.007)；与模型组比较,MAG低、中、高剂量组(5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg)大脑SOD水平显著高于模型组(P=0.050,P=0.011,P=0.001),表明芒果苷对脑缺血再灌注后脑组织SOD活力有一定恢复作用。阳性对照药依达拉奉组大脑SOD活力显著高于模型组(P=0.014)。模型组大脑GSH含量显著低于假手术组(P=0.000)；与模型组比较,仅高剂量组(20mg/kg)脑组织GSH含量显著高于模型组(P=0.002),低、中剂量组(5mg/kg、10mg/kg)则无显著性差别(P=0.994,P=0.171)；阳性对照药依达拉奉组GSH含量显著高于模型组(P=0.001)。模型组大脑MDA含量与假手术组比较有显著升高(P=0.000),表明缺血再灌注后脑组织脂质过氧化反应强烈,伴有脑组织自由基的聚积以及抗氧化酶活性的降低；与模型组比较,MAG低、中、高剂量(5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg)脑组织MDA含量显著低于模型组(P=0.000,P=0.000,P=0.000),表明MAG对缺血再灌注后脑组织脂质过氧化反应有显著抑制作用。阳性对照药依达拉奉组MDA含量显著低于模型组(P=0.000)。6.MAG对缺血再灌注大鼠脑炎症因子IL-1β,TNF-α的影响定量RT-PCR分析显示在假手术组中,脑组织IL-1βmRNA与TNF-α mRNA的表达较低,在缺血再灌注后均显著上升。缺血2h,再灌注24h后,模型组缺血脑组织匀浆中IL-1β mRNA与TNF-α mRNA的表达均显著高于假手术组(P=0.004,P=0.000)。与模型组比较,芒果苷低、中、高剂量组显著降低IL-1pmRNA的表达(P=0.000,P=0.000,P=0.000),且呈一定剂量依赖性；与模型组比较,MAG低、中、高剂量组显著降低TNF-α mRNA的表达(P=0.000,P=0.000,P=0.001)；阳性对照药依达拉奉与模型组比较也显著降低IL-1βmRNA与TNF-α mRNA的表达(P=0.001, P=0.000)。ELISA法在蛋白质水平也证实了上述对炎症因子的抑制作用。7.MAG对PC12细胞OGD损伤后细胞形态学的影响正常对照组PC12细胞生长速度快,接种3d后,在倒置显微镜下可看到PC12细胞贴壁生长,形状呈梭形、三角形,边界清楚,胞浆丰富,突触相互交织成网状,折光性强,呈典型的神经元形态。模型组细胞折光度减弱,细胞圆缩、脱落。模型中PC12细胞的损伤及药物保护的形态学表现基本一致,MAG各组和阳性对照组的细胞损伤程度均有所减轻,呈现一定的药物形态保护。8.MAG对PC12细胞OGD损伤后细胞存活率及LDH漏出量的的影响MAG低、中、高剂量组(5,10,20μM)及阳性对照药依达拉奉(10μM)对氧糖剥夺模拟的缺血性损伤有明显的神经保护作用。与正常对照组比较,模型组细胞存活率显著降低(P=0.000)。MAG各组呈剂量依赖性的提高细胞存活率,与模型组比较有显著差异(P<0.01)。与正常对照组比较,模型组细胞LDH释放量显著增加(P<0.01)；而MAG各组呈剂量依赖性减少LDH释放量,与模型组比较有显著差异(P<0.01)。阳性对照组提高细胞存活率,降低LDH漏出量,与模型组相比有统计学意义(P<0.01)。结论MAG能够在大鼠脑缺血再灌注后显著升高脑组织中SOD活性和GSH含量,降低MDA含量,从而增强自由基清除能力,减轻脂质过氧化损伤；降低脑组织中炎症因子IL-1β mRNA与TNF-α mRNA基因的表达,从蛋白质水平也证实了对上述两个炎症因子的抑制作用,从而显示其抗炎作用；同时MAG还能增强氧糖剥夺损伤后PC12细胞的存活力,降低细胞上清中LDH含量。这些可能是MAG能改善脑缺血后大脑的组织形态学变化,缩小脑梗死面积,减轻脑水肿损伤,促进神经功能恢复,有效治疗局灶性脑缺血再灌注损伤,发挥神经保护作用的重要机制。