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ES2-AF(IVRRADRAAVPGGGGGGNQWFI)是一种具有抗新生血管生成活性的多肽,其相对分子质量为2197.51Da。它可抑制内皮细胞增殖、迁移同时还可通过与VEGFR1受体特异性结合,抑制VEGFR1受体与VEGFA、VEGFB、PIGF等一系列配体相结合,从而发挥其抗新生血管生成的活性。已有研究表明,ES2-AF具有较高的抑制内皮细胞增殖的作用。在体外管腔形成实验和体内鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验中,ES2-AF分别表现出显著地抑制内皮细胞管腔生成和新生血管的生成的作用。但是ES2-AF仍然存在稳定性差和半衰期短的缺点。透明质酸(Hyaluronic acid,HA)是由β-N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸组成的、带负电荷的、非硫酸化的线性糖胺聚糖。HA良好的生物相容性、生物可降解性、非免疫原性和非毒性等特点,使其被广泛的用作传递药物的载体。另外,HA可与多种细胞膜表面受体结合,如CD44、RHAMM、IVd4和LEC等。其中CD44受体在许多肿瘤细胞表面高表达。可与之紧密结合的HA在抗肿瘤药物载体研究中被广泛使用。本课题拟使用HA对ES2-AF进行化学修饰,在提高其稳定性和延长半衰期的基础上,赋予其一定的肿瘤靶向性。本课题主要研究内容和结果如下:1.ES2-AF及HA-ES2-AF结合物的合成与表征(1)采用Fmoc固相合成法合成抗新生血管生成肽ES2-AF,由高效液相色谱进行纯化,纯度均达95%以上,并进行结构确证。为使HA溶于有机溶剂与ES2-AF肽偶联,首先采用离子交换法制得透明质酸的四丁基氢氧化铵盐(HA-TBA),然后使用卡特缩合剂BOP活化羧基,最后在N,N—二异丙基乙胺DIPEA的催化下制备HA-ES2-AF结合物。经核磁共振氢谱分析结果,确定每条HA链上连接75个肽。(2)粒径、Zeta电位及透射电镜TEM观察粒子形态实验结果表明,ES2-AF和HA-ES2-AF 的粒径大小分别为144.13±4.36 nm和 245.4±16.59 nm,Zeta电位分别为-0.49±0.013 mV和-17.7±0.2 mV。且HA-ES2-AF在水相中呈现出纳米状样的球形结构。2.HA-ES2-AF促内皮细胞凋亡和对内皮细胞周期影响的研究(1)采用CCK-8试剂盒检测ES2-AF,HA-ES2-AF和HA&ES2-AF抑制内皮细胞增殖作用的影响。结果表明ES2-AF,HA-ES2-AF和HA&ES2-AF在5μg/mL、25μg/mL、75μg/mL、150μg/mL、250μg/mL、400μg/mL时的抑制率分别为(6.35%±2.70%)、(10.90%±2.76%)、(14.62%土1.65%)、(22.06%±5.57%)、(28.27%±4.65%)和(39.16%±4.86%);(13.78%±1.17%)、(16.12%±2.03%)、(26.17%±1.63%)、(31.95%±2.63%)、(40.21%±2.87%)和(45.48%±2.09%);(5.56%±2.95%、(5.96%±2.10%)、(16.33%±4.28%)、(20.68%±2.99%)、(32.33%±8.28%)和(31.05%±0.46%)。三种药物以剂量依赖性方式抑制内皮细胞增殖,且与ES2-AF和HA&ES2-AF相比,HA-ES2-AF表现出对内皮细胞增殖的最大抑制作用。(2)HA-ES2-AF结合物对内皮细胞亲和性研究将ES2-AF-FTIC、HA-ES2-AF-FTIC、HA&HA-ES2-AF-FTIC分别与内皮细胞孵育,使用流式细胞仪检测阳性细胞率。结果表明,浓度为0.5μg/mL,1μg/mL,2μg/nmL,5μg/mL,10μg/mL,25μg/mL时,ES2-AF与内皮细胞的亲和率分别为(4.55%±0.61%)、(22.79%±5.20%)、(82.99%±3.99%)、(99.61%±0.62%)、(99.63%±0.06%)和(99.96%±0.01%)。阳性细胞率随着药物浓度的增加而增加。(3)采用Annexin-V法检测经不同浓度的HA-ES2-AF,ES2-AF及HA&ES2-AF处理的内皮细胞的凋亡,结果表明,ES2-AF,HA-ES2-AF和HA&ES2-AF在浓度为5 μg/mL、25 μg/mL、50μg/mL、100 μg/mL时的细胞凋亡率分别为(5.44%±1.64%),(7.53±0.74%),(28.86%±1.49%)、(36.64%±0.74%)、(8.28%±1.44%)、(15.62%±0.94%)、(26.85%±2.42%)、(32.40%±1.61%)、(4.47%±1.00%)、(6.45%±1.15%)、(9.36%±1.57%)、(14.8%±3.46%)。细胞凋亡率随着浓度的增加而增加,HA-ES2-AF诱导内皮细胞凋亡与ES2-AF诱导结果没有显著性差异,HA-ES2-AF保留了原来生物活性。(4)使用PI试剂盒检测HA-ES2-AF和ES2-AF对内皮细胞周期的影响。结果表明,对照组中内皮细胞G1期,S期和G2期所占百分比分别为(54.03%±2.77%)、(35.38%±1.98%)和(10.59%±1.11%);ES2-AF组内皮细胞G1期,S期和G2期所占百分比分别为(64.30%±7.01%)、(26.22%±3.02%)和(9.48%±4.12%);HA-ES2-AF组内皮细胞G1期,S期和G2期细胞所占百分比分别为(66.30%±10.04%)、(25.92%±8.87%)和(7.64%±1.34%)。两种药物将内皮细胞周期都抑制在G1期。3.HA-ES2-AF结合物的稳定性研究(1)HA-ES2-AF结合物的热稳定性研究分析研究HA-ES2-AF、ES2-AF分别在室温(25℃)、体温(37℃)中孵育相同时间后,使用CCK-8检测药物保留活性。结果表明,25℃孵育90min后,ES2-AF保留活性低于50%,而HA-ES2-AF保留活性仍高于60%。在37℃温育90min后,ES2-AF和HA-ES2-AF保留活性分别为(40.49%±6.30%)和(53.62%±2.30%)。与修饰前相比,HA-ES2-AF的热稳定性显着提高。(2)HA-ES2-AF结合物长期稳定性研究分析研究HA-ES2-AF、ES2-AF在-80℃条件下长期储存且反复冻融相同时间后,测其保留活性。结果表明,-80℃储存1d后,ES2-AF保留活性为(46%±3.90%),HA-ES2-AF保留活性为(98.55%±8.63%)。在-80℃储存31d后,ES2-AF保留活性仅为(30.68%±4.33%),而结合物HA-ES2-AF保留活性为(48.58%±2.13%)。相比于ES2-AF,修饰后的HA-ES2-AF表现出更高保留活性,说明HA修饰后提高药物长期储存稳定性。(3)HA-ES2-AF结合物pH稳定性研究ES2-AF和HA-ES2-AF分别在pH为3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、9条件下孵育相同时间后,测其保留活性。结果表明,ES2-AF和HA-ES2-AF在3.5～9条件下的保留活性百分比分别为(6.54%±2.10%)、(16.00%±4.36%)、(21.47%±1.43%)、(23.71%±2.34%)、(25.81%±3.91%)、(27.44%±1.24%)、(28.46%±1.72%)、(31.22%±2.39%)、(35.31%±0.81%)、(20.37%±2.97%)、(14.77%±2.11%);(17.98%±2.60%)、(25.69%±2.53%)、(28.77%±0.48%)、(28.22%±5.61%)、(32.25%±1.95%)、(34.78%±2.56%)、(36.36%±1.10%)、(37.23%±5.72%)、(36.39%±4.63%)、(29.37%±4.7%)、(20.07%±4.00%)。ES2-AF在pH为5.0表现出最高活性,而HA-ES2-AF结合物在pH为4.0～7.5的范围表现出较高的生物活性。4.HA-ES2-AF结合物的体内靶向性研究采用活体成像技术研究ES2-AF、HA-ES2-AF、HA&HA-ES2-AF在体内对肿瘤组织靶向能力。结果表明,尾静脉注射2h后,ES2-AF-FITC主要分布在颈部淋巴结附近,而HA-ES2-AF-FITC主要分布于腹部和颈部淋巴结,且在肿瘤部位有弱小荧光量出现。HA-ES2-AF相比于其他两组,肿瘤组织中荧光强度最强。给药4 h后,ES2-AF-FITC在肿瘤和膀胱处有少量荧光信号。HA-ES2-AF-FITC开始在肿瘤中积聚。8 h后,ES2-AF-FITC在肾区域中浓缩,表明大部分ES2-AF-FITC已被代谢。此时,HA-ES2-AF-FITC在肿瘤部位的荧光信号强度和面积明显增强。12 h后,HA-ES2-AF-FITC和HA&HA-ES2-AF-FITC在肿瘤部位的荧光信号强度和面积明显减少,膀胱内发现少量荧光区域,表明两种药物都开始少量代谢。24h后,HA-ES2-AF-FITC仍存在于肿瘤和颈部淋巴结中,膀胱部位也有大面积荧光,表明24h后代谢药物仍然存在。化学修饰后的HA-ES2-AF-FITC在裸鼠体内代谢率低于ES2-AF-FITC,且在血浆中半衰期较长,不易被水解。5.HA-ES2-AF结合物的体内抗肿瘤作用研究CD44是一种被广泛表达于多种细胞表面的跨膜糖蛋白,能够参与细胞的粘附,与细胞外基质或者配体相结合,具有信息传导等生理功能。其中,透明质酸(HA)是CD44主要配体,HA可作为靶向因子靶向高度表达CD44受体的肿瘤细胞表面,提高肿瘤药物的靶向性,实现主动靶向。本课题分别使用B16F10和HepG2荷瘤裸鼠模型,研究HA-ES2-AF与ES2-AF的体内抗肿瘤作用。(1)通过体内荷瘤裸鼠(黑色素瘤)移植瘤模型研究HA-ES2-AF抑瘤效果。结果表明,相比于对照组,HA-ES2-AF组抑瘤率显著高于ES2-AF给药组抑瘤率,达到51.15%。通过免疫组化染色检测荷瘤小鼠肿瘤组织中VEGF,MVD的表达情况。结果表明,相比于对照组,ES2-AF组和HA-ES2-AF组VEGF,MVD表达量下降,且HA-ES2-AF组表达量下降效果更显著。(2)通过体内荷瘤裸鼠(HepG2)移植瘤模型研究HA-ES2-AF抑瘤效果。结果表明,相比于对照组,HA-ES2-AF抑瘤率显著高于ES2-AF给药组抑瘤率,达到51.15%。通过免疫组化染色研究荷瘤小鼠肿瘤组织中VEGF,MVD,Bcl-2,caspase-3,caspase-9和细胞色素c表达情况。结果表明,相比于对照组,ES2-AF组和HA-ES2-AF组VEGF,MVD和Bcl-2抗凋亡蛋白表达量下降,细胞色素c,caspase-3和caspase-9蛋白表达量增加,且HA-ES2-AF组作用效果更显著。