目的:中国是食管癌的高发区,今年来,食管癌的发病率在逐年上升。为了研究食管癌的发生机制,本实验室对食管癌高发区居民饮食中的毒素污染情况进行了长达10年的监测,系统地探讨了黄曲霉毒素、杂色曲霉素和脱氧雪腐镰刀菌烯醇在食管癌发生发展中的作用,首次发现了这三种毒素都可以影响免疫细胞的功能,降低抗原加工提呈相关分子的表达,其中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的作用更为明显。脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)又名呕吐毒素(vomitoxin, VT),在我国一些消化道肿瘤,比如胃癌和食管癌的高发区域,DON的污染极为突出,DON的检出率和检出量位于各真菌毒素污染之首。有研究表明,DON可以明显影响人和动物的免疫功能。有研究进一步发现,DON的倍半萜烯结构是其抑制免疫功能的本源,它可以抑制转录、翻译和蛋白合成等过程,同时,DON也可以通过干扰机体内正常的免疫调节而增强免疫功能。因此,DON对免疫功能有正反两方面的影响,既可以抑制机体的免疫应答,又可以诱发自身免疫反应。有研究发现,DON可以抑制免疫细胞增殖并且诱导其凋亡,同时可以激活巨噬细胞、T细胞产生炎症前细胞因子,辅助性T细胞产生细胞因子。HLA-I类分子和抗原加工转运相关分子的正常表达是保证机体正常免疫功能的前提。对于DON作用于人正常食管鳞状上皮后免疫相关分子的表达情况,国内外均鲜有报道。本研究运用细胞培养,免疫细胞化学,Western blot,RT-PCR方法检测了DON(1000μg/L)处理6h、12h、24h、36h小时后,原代培养的人正常食管上皮细胞HLA-abc、TAP-1、LMP-2和CNX蛋白和mRNA表达变化情况,分析了DON处理不同时间影响抗原提呈相关分子表达的时间效应关系,进一步揭示DON暴露对人免疫功能可能的负面影响以及在我国食管癌高发区肿瘤发生发展中的可能作用。方法:1人正常食管上皮细胞原代培养在无菌条件下,将食管粘膜组织用含有青霉素200U/ml、链霉素200μg/ml的PBS溶液反复冲洗至无血迹为止,剪除粘膜下层多余的血管和结缔组织,置于25g/L中性蛋白酶(Dispase)中消化24h,用眼科镊将粘膜层撕下,放入25g/L胰酶中,37℃消化20-30min,其后加入等量含10%胎牛血清的1640培养基终止消化,吹打成单细胞悬液,以1500r/min离心5min,再用PBS溶液清洗2次后,加入K-SFM无血清培养基,按(0.1-1.0)×106个/cm2接种于25cm2培养瓶,放入37℃5%CO2的培养箱培养。待细胞贴壁后首次换液,以后每2-3天换液一次。2人正常食管上皮细胞的鉴定倒置显微镜下观察细胞细胞形态和生长情况,细胞爬片后用广谱CK进行免疫细胞化学染色,鉴定细胞来源。3实验分组与处理当人正常食管上皮细胞生长铺满瓶底70%-80%时,随机分为处理组和对照组。处理组加DON(1mg/ml)至终浓度为1000μg/L,作用时间为6h、12h、24h和36h,对照组加入等量的生理盐水。胰酶消化细胞并离心收集或细胞爬片后检测各指标表达情况。4细胞总RNA的提取、鉴定及定量采用Trizol法提取细胞总RNA。1%琼脂糖电泳鉴定其完整性。紫外分光光度计进行定量。5 RT-PCR应用RT-PCR方法检测DON处理不同时间对人正常食管鳞状上皮细胞HLA-abc、TAP-1、LMP-2和CNX mRNA表达的影响。采用凝胶分析软件(BIO-LD)进行定量分析,各组以目的基因与内参照基因GAPDH量的比值表示目的基因相对表达量。6细胞总蛋白的提取和定量应用预冷的细胞裂解液加入收集的细胞中,提取细胞总蛋白。将提取的蛋白应用紫外分光光度计进行定量。7蛋白印迹(Western Blotting)提取的细胞总蛋白,用Western blot方法,检测DON处理不同时间对人正常食管上皮细胞HLA-abc、TAP-1、LMP-2和CNX蛋白表达水平的影响。8免疫细胞化学染色细胞爬片后,采用免疫细胞化学SP法,严格按照操作说明进行,DAB显色,显微镜下观察。9统计分析各项数据均以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析(analysis of variance, ANOVA),用SNK法进行两两比较。结果:1原代培养的人正常食管上皮细胞的形态学观察和鉴定经酶消化的单细胞悬液接种到玻璃培养瓶后,加入K-SFM无血清培养基,1-2天单细胞聚集成细胞团,3-4天开始贴壁,细胞成圆形、椭圆形和多边形,体积较大,轮廓不清,胞浆透明,胞核大而清,细胞融合后,排列紧密,呈典型的“铺路石”状排列(Fig.3)。成纤维细胞污染少,而且随着时间的延长,成纤维细胞逐渐减少,最后基本消失。免疫细胞化学染色显示90%细胞呈广谱CK阳性,证明培养细胞是食管鳞状上皮细胞。2 DON处理不同时间对人正常食管上皮细胞HLA-abc、TAP-1、LMP-2和CNX表达的影响2.1 DON处理不同时间对HLA-abc表达的影响Western印迹检测结果显示:人正常食管上皮细胞经DON(1000μg/L)处理后,6h-36h处理组HLA-abc蛋白的相对表达量与对照组相比呈先升高再降低的趋势。6h和12h处理组高于对照组水平,24h和36h处理组低于对照组水平,其中12h处理组与对照组相比具有显著性差异(P<0.05),其余各组与对照组相比无显著性差异。RT-PCR结果显示:人正常食管上皮细胞经DON(1000μg/L)处理后,6h-36h处理组HLA-a mRNA相对表达量均高于对照组水平,随着时间的延长,处理组HLA-a mRNA相对表达量逐渐下降至正常水平。其中6h、12h和24h处理组与对照组相比具有显著性差异(P<0.05),36h组与对照组相比无显著性差异。人正常食管上皮细胞经DON(1000μg/L)处理后,6h-36h处理组HLA-bmRNA的相对表达量均高于对照组水平,随着时间的延长,处理组HLA-b mRNA相对表达量逐渐下降。其中6h、12h和36h组与对照组相比差异有显著性(P<0.05),24h组与对照组相比无显著性差异。人正常食管上皮细胞经DON(1000μg/L)处理后,6h-36h处理组HLA-c mRNA的相对表达量呈先降低后升高的趋势,随着时间的延长,处理组相对表达量有所下降。其中6h处理组显著低于对照组水平(P<0.05),12h和24h处理组显著高于对照组水平(P<0.05),36h与对照组相比无显著性差异。2.2 DON处理不同时间对TAP-1表达的影响Western印迹检测结果显示:人正常食管上皮细胞经DON(1000μg/L)处理后,6h-36h组TAP-1蛋白的相对表达量与对照组相比呈先升高再降低的趋势, 6h处理组高于对照组水平,12-36h处理处低于对照组水平,各处理组与对照组相比均无显著性差异。RT-PCR结果显示:人正常食管上皮细胞经DON(1000μg/L)处理后,6h-36h处理组TAP-1 mRNA的相对表达量与对照组相比呈先降低再升高的趋势。其中6h处理组显著低于对照组水平(P<0.05),12h-36h处理组均显著高于对照组水平(P<0.05)。2.3 DON处理不同时间对LMP-2表达的影响Western印迹检测结果显示:人正常食管上皮细胞经DON(1000μg/L)处理后,6h-36h处理组LMP-2蛋白的相对表达量均高于对照组水平且具有显著性差异(P<0.05)。RT-PCR结果显示:人正常食管上皮细胞经DON(1000μg/L)处理后,6h-36h处理组LMP-2 mRNA的相对表达量均高于对照组水平,其中12h和36h处理组与对照组相比具有显著性差异(P<0.05)。2.4 DON处理不同时间对CNX表达的影响Western印迹检测结果显示:人正常食管上皮细胞经DON(1000μg/L)处理后,6h-36h处理组CNX蛋白的相对表达量与对照组相比呈先升高再降低的趋势,随着时间的延长,处理组相对表达量逐渐下降至正常水平,其中12h处理组达最高点且显著高于对照组水平(P<0.05),其余各处理组与对照组相比无显著性差异。RT-PCR结果显示:人正常食管上皮细胞经DON(1000μg/L)处理后,6h-36h处理组CNX mRNA的相对表达量均高于对照组水平,随着时间的延长,处理组相对表达量有所下降,其中12h和36h组与对照组相比有显著性差异(P<0.05)。结论:1酶消化法加K-SFM无血清培养基培养的人正常食管上皮细胞生长好,细胞融合快,成纤维细胞污染基本消除,细胞纯度高,10-12天细胞便可以铺满瓶底的70%-80%,这种方法培养的细胞可以冻存、复苏和传代,是本实验获得的原代培养食管上皮细胞的最佳方法。2在处理6h-12h范围内,DON(1000μg/L)可以在蛋白及mRNA水平上促进人正常食管上皮细胞HLA-abc、LMP-2和CNX的表达,在mRNA水平上促进TAP-1的表达。在处理12h-36h范围内,DON(1000μg/L)对HLA-abc、LMP-2、CNX蛋白及mRNA和TAP-1 mRNA的促进作用明显减弱。3在处理6h-36h范围内,DON(1000μg/L)对人正常食管上皮细胞TAP-1蛋白无明显影响。4在处理6h-36h范围内,DON(1000μg/L)可以影响人正常食管上皮细胞HLA-Ⅰ类分子及其相关分子的蛋白和mRNA的表达,而且随处理时间不同影响也不同,变化比较复杂。短时间内DON表现为促进作用,随着处理时间的延长,DON的促进作用逐渐减弱。DON可以造成HLA-I类抗原提呈环节的紊乱。