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背景卵巢储备功能减退(diminished ovarian reserve,DOR)是指卵巢内卵母细胞数目的减少和(或)质量下降,可导致生育力下降,同时伴有抗苗勒管激素(anti-Mullerian hormone,AMH)水平降低、窦卵泡计数(antral follicle count,AFC)减少及促卵泡激素(follicle-stimulating hormone,FSH)水平升高。随着社会发展,女性面临的生活压力和工作压力逐渐加重,DOR发病率逐年上升,由此导致的不孕严重影响女性生殖健康和生活质量,给其家庭带来沉重的精神及经济负担。FSH是下丘脑-垂体-卵巢(Hypothalamic-pituitary-ovarian,HPO)轴的主要激素之一,可促进颗粒细胞的增殖分化,影响卵泡的发育、成熟及排卵,影响雌激素的合成。FSH与其特异性受体(FSHR)的结合是其发挥生物学效应的基础。FSH与FSHR结合,可进一步激活环磷酸腺苷(Cyclic adenosine monophosphate,cAMP)/蛋白激酶 A(Protein kinase A,PKA)信号转导通路下游信号分子的级联放大,从而影响颗粒细胞增殖分化和卵巢性激素的合成。P450芳香化酶(P450arom)是颗粒细胞中的限速酶,P450arom催化作用使雄激素变为雌激素参与卵泡募集。临床试验显示,针刺可以降低血清FSH水平,提高血清雌二醇(Estradiol,E2)水平,通过调整异常的性激素水平而起到改善卵巢储备功能的作用。动物实验也表明,针刺可调整HPO轴的紊乱状态,一定程度上使分泌过多的下丘脑促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing hormone,GnRH)水平恢复正常。FSH-cAMP信号通路对卵泡发育和卵巢功能十分关键,但基于该信号通路的针刺方面的研究较少。本实验从HPO轴整体调控及卵巢局部FSH-cAMP信号通路两个层面初步探索针刺治疗DOR的作用机制。目的探索针刺对DOR模型大鼠HPO轴及FSH-cAMP信号通路的影响。方法实验一:DOR动物模型的建立及验证20 只清洁级(Specific Pathogen Free,SPF)级雌性 Sprague Dawley(SD)大鼠,其中,3月龄大鼠10只,9月龄退役种鼠10只。3月龄大鼠作为对照(Control)组,9月龄退役种鼠作为DOR模型组。常规观察大鼠每日的阴道涂片以确定动情周期,选择处于动情间期的大鼠取材。ELISA法检测血清性激素(FSH、LH、E2、AMH、抑制素B(INH-B))水平、冰冻切片HE染色方法确定左侧卵巢窦卵泡计数。实验二:针刺对DOR大鼠HPO轴及FSH-cAMP信号通路的影响40只清洁级(Specific Pathogen Free,SPF)级雌性SD大鼠,其中,3月龄大鼠10只,9月龄退役种鼠30只。3月龄大鼠作为对照组(Control组),9月龄退役种鼠依据动情间期眼眶血FSH水平,区组随机分为三组:DOR模型组(DOR组)、束缚组(DOR+res组)、针刺组(DOR+acu组)。Control组及DOR组不予干预,DOR+res抓取后放置高台作为束缚固定,DOR+acu组针刺后放置高台,取穴为百会、关元、次髎穴,隔日一次,每次针刺20分钟,共针刺10次。常规观察大鼠每日的阴道涂片以确定动情周期。实验干预结束后选择处于动情间期的大鼠取材。ELISA法检测血清性激素(FSH、LH、E2、AMH、抑制素B(INH-B))水平、下丘脑GnRH含量、垂体FSH和LH含量及卵巢组织cAMP含量。Western Blot法检测卵巢组织FSHR蛋白的相对含量。实时荧光PCR法检测卵巢组织的FSHR mRNA及P450 mRNA相对含量。冰冻切片HE染色方法确定左侧卵巢的形态学改变及窦卵泡计数。结果实验一:DOR动物模型的建立及验证1.动情周期与Control组相比,DOR组大鼠动情周期紊乱率显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。2.血清激素水平与Control组相比,DOR组大鼠的血清FSH水平明显升高,E2、AMH水平明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。血清LH、INH-B未见统计学差异(P>0.05)。3.窦卵泡计数与Control组相比,DOR组大鼠的窦卵泡数量明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。实验二:针刺对DOR大鼠HPO轴及FSH-cAMP信号通路的影响1.针刺对DOR大鼠HPO轴的影响(1)下丘脑组织GnRH含量:与control组相比,DOR组大鼠下丘脑组织中GnRH水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.01)。与DOR组相比,DOR+res组和DOR+acu组的GnRH水平显著降低,差异有显著统计学意义(P<0.01)。与DOR+res组相比,DOR+acu组的GnRH水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)垂体组织FSH和LH含量:四组大鼠垂体组织FSH及LH含量的组间两两比较均未见统计学差异(P>0.05)。(3)针刺对DOR大鼠卵巢储备功能的影响:①动情周期紊乱率:与control组相比,DOR组大鼠动情周期紊乱率明显升高,差异有统计学意义(P<0.01)。与DOR组相比,DOR+res组动情周期紊乱率呈升高趋势,但差异无统计学意义(P>0.05);DOR+acu组动情周期紊乱率呈降低趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。与DOR+res组相比,DOR+acu组动情周期紊乱率显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。②卵巢组织形态学改变:Control组大鼠卵巢切面皮质较连续,卵泡中颗粒细胞排列紧密,髓质较致密,血管形态完好。DOR组大鼠的卵巢切面皮质不连续,卵泡中颗粒细胞排列紊乱,髓质较稀疏,血管形态不完整。DOR+res组卵巢切面皮质连续性较差,颗粒细胞层连续性欠佳,髓质松散,血管分布较少。DOR+acu组卵巢切面皮质较连续,卵巢颗粒细胞层有增多趋势,髓质结构较稀松散,血管分布较少。③窦卵泡计数:与control组相比,DOR组窦卵泡计数显著减少,差异有统计学意义(P<0.05)。DOR组、DOR+res组和DOR+acu组三组之间窦卵泡数未见显著差异(P>0.05)。④血清性激素水平:与control组相比,DOR组大鼠血清FSH和LH水平显著升高,AMH和E2水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.05),但INH-B水平未见显著差异(P>0.05)。与DOR组相比,DOR+res组血清5种激素水平均未见显著差异(P>0.05)。与DOR组相比,DOR+acu组血清FSH水平显著降低,E2和AMH水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.05),其余2种激素水平未见显著差异(P>0.05)。与DOR+res组相比,DOR+acu组血清5种激素水平均未见显著差异(P>0.05)。2.针刺对DOR大鼠FSH-cAMP信号通路的影响:(1)卵巢组织FSHR相对表达量:与control组相比,DOR组大鼠卵巢组织FSHR蛋白相对表达量显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。与DOR组相比,DOR+res组大鼠卵巢组织FSHR蛋白相对表达量未见显著差异(P>0.05)。与DOR和DOR+res组相比,DOR+acu组大鼠卵巢组织FSHR蛋白相对表达量均显著升高,差异有统计学意义(P<0.01)。(2)卵巢组织FSHR mRNA及P450 mRNA相对表达量:①FSHR mRNA相对表达量改变:与Control组相比,DOR组大鼠卵巢组织FSHR mRNA相对表达量显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。与DOR组相比,DOR+res组大鼠卵巢组织FSHR mRNA相对表达量未见显著差异(P>0.05)。与DOR组相比,DOR+acu组大鼠卵巢组织FSHR mRNA相对表达量显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与DOR+res组相比,DOR+acu组大鼠卵巢组织FSHR mRNA相对表达量未见显著差异(P>0.05)。②P450 mRNA相对表达量改变:与Control组相比,DOR组大鼠卵巢组织P450 mRNA相对表达量显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。与DOR组相比,DOR+res组和DOR+acu组大鼠卵巢组织P450 mRNA相对表达量均显著升高,差异有统计学意义(P<0.01)。与DOR+res组相比,DOR+acu组大鼠卵巢组织P450 mRNA相对表达量未见显著差异(P>0.05)。(3)卵巢组织cAMP含量:与Control组相比,DOR组大鼠卵巢组织的cAMP含量显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。与DOR组相比,DOR+res组大鼠卵巢组织的cAMP含量均未见显著差异(P>0.05)。与DOR组及DOR+res组相比,DOR+acu组卵巢组织的cAMP含量显著升高,差异有统计学意义(P<0.01)。结论1.与三月龄雌性大鼠相比,九月龄SD大鼠雌性退役种鼠的卵巢储备功能明显减退,可作为DOR动物模型。2.针刺可降低DOR大鼠下丘脑组织GnRH含量。3.针刺可通过调整紊乱的动情周期及异常的性激素水平一定程度上改善DOR大鼠的卵巢储备功能。4.卵巢颗粒细胞FSH-cAMP信号转导通路可能参与针刺对DOR大鼠卵巢储备功能的调控,该部分结果还需进一步验证。