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目的：针对化疗药物的加入是否会妨碍膀胱癌特异性重组溶瘤腺病毒的复制和化疗药物与腺病毒是否会阻碍彼此的治疗功能这两个疑问,本文通过细胞及分子生物学试验方法,检测AD-UPⅡ-E1A体外转染膀胱癌细胞后,腺病毒介导的E1A基因的转染,Ad-UPⅡ-E1A联合化疗药物后对膀胱癌细胞体外生长的抑制作用,对细胞凋亡的影响和化疗对腺病毒复制和功能的影响,进一步探讨了相关分子机制,为未来腺病毒与化疗联合的临床应用提供理论依据。方法：用Ad-UPⅡ-E1A联合不同浓度的MMC或HCPT作用于3种膀胱癌细胞。细胞生存率测定及协同效应分析：应用短期噻唑蓝法(MTT)检测量化,膀胱癌细胞培养基中加入10MOI Ad-UPⅡ-E1A作用2小时后加入不同浓度的MMC或HCPT继续培养,于Ad-UPⅡ-E1A感染24,48,72,96小时后分别进行MTT测定,金氏公式法计算分析协同效应。E1A蛋白表达检测：联合作用或腺病毒单独作用于5637细胞72小时后,提取细胞内总水溶性蛋白,Western blot检测E1A蛋白表达。细胞周期分析：联合作用或腺病毒单独作用于5637细胞48,72,96小时后分别用胰酶消化收集细胞,PBS清洗,70%乙醇中4℃固定12小时以上,PBS重悬细胞,加入PI和RNaseA37℃温浴30分钟。流式细胞仪(Beckman Coulter Epics XL, USA)测定周期,根据流式报告中给出的GO/G1、S、G2/M各期细胞的百分比,进行凋亡百分比和细胞倍体结果分析。细胞凋亡分析：按照Apoptosis Assay Kit#2说明书对膀胱癌细胞进行处理后,流式细胞仪(Beckman Coulter Epics XL, USA))观察Annexin V-FITC和PI的荧光信号,激发波长Ex=488nm；发射波长Em=530nm,分析正常细胞,早期凋亡及死亡细胞分布。细胞亚结构及细胞形态分析：5637细胞进行干预72小时后,悬浮于2.5%戊二醛和1%饿酸双重固定1小时,乙醇逐级脱水后用环氧树脂包埋,超薄切片机(Ultrotome)进行切片,用柠檬酸铅和醋酸铀对切片进行染色,C02临界点干燥,真空喷金,透射电子显微镜(JEM-1230,日本)下观察并拍照。结果：通过体外细胞毒实验发现,化疗药物联合腺病毒作用组的细胞杀伤效应最明显,说明腺病毒增加了膀胱癌细胞的化疗敏感性,联合治疗策略具有有效性。实验数据表明：细胞生存抑制与药物剂量正相关,但细胞生存率的下降速度与药物剂量没有明显的相关性。金氏公式法分析协同效应,结果表明化疗联合腺病毒在5637细胞中有明显的协同抑制增殖作用,EJ细胞次之,BIU-87协同作用最不明显,在部分时间段还出现相互抑制。E1A蛋白在不同化疗联合组细胞内表达水平没有明显差异,说明化疗药物的加入没有影响病毒的复制,二者在体外作用时没有冲突。电镜下观察细胞亚显微结构也证明了这一点,病毒在联合作用后的细胞中广泛存在,分散或规则排列,细胞出现了早期和晚期凋亡表型,说明药物的加入没有影响溶瘤腺病毒复制和诱导凋亡效应的发挥。结论：这些研究结果说明,Ad-UPII-E1A结合MMC或HCPT治疗能够协同抑制膀胱癌并诱导细胞凋亡,为生物治疗的临床研究提供了理论依据。