睾丸酮丛毛单胞菌（Comamonas testosteroni,C.T.）是一种能够降解甾体类激素的细菌,在菌体进行激素降解的过程中有许多蛋白参与其中,蛋白质很少能单独发挥作用,正因如此,睾丸酮丛毛单胞菌的生物修复作用及激素降解相关基因的作用机理、表达调控成为研究热点。3,17β-HSD和3α-HSD是睾丸酮丛毛单胞菌ATCC11996中两个重要的激素降解酶,而SDRy在睾丸酮诱导的C.T.菌转录组分析结果中与这两种酶上调的水平相当,且本实验室已有研究证明其也参与C.T.菌对激素的降解作用。本文通过文通过基因敲除、重组质粒构建、高效液相色谱、酶联免疫吸附、免疫共沉淀、质粒共转化等方法,对C.T.菌中3,17β-HSD与3α-HSD的蛋白质相互作用组进行研究。构建3,17β-HSD与3α-HSD的基因敲除株,并通过HPLC检测敲除株的激素降解能力;原核表达并纯化3,17β-HSD与3α-HSD蛋白,制备出两种蛋白的多克隆抗体,所得抗体与睾丸酮诱导的C.T.菌全蛋白进行免疫共沉淀,初步分析相互作用蛋白;将3,17β-HSD抗体免疫共沉淀样品,进行胶条鉴定分析;进行共转化实验,运用Western Blot技术分析共转化质粒的作用。研究结果如下:1)成功构建出基因敲除株MC.T-3,17β-HSD与MC.T-3α-HSD,通过HPLC对敲除突变菌株的激素降解水平分析发现突变株降解睾丸酮的能力显著下降,野生型C.T.菌降解率为99%,MC.T-3,17β-HSD降解率为6%,MC.T-3α-HSD降解率为30%;2)成功制备了3,17β-HSD与3α-HSD的多克隆抗体,效价分别为1:200,1:320000,免疫共沉淀的蛋白电泳结果显示与两个目标蛋白分别洗脱的蛋白大小都集中在26～45KDa之间,约有6到8个相互作用蛋白;3)免疫共沉淀结果进行Western Blot分析,发现3,17β-HSD和3α-HSD均结合了SDRy蛋白,3,17β-HSD抗体与睾丸酮诱导的C.T.菌全蛋白的免疫共沉淀胶条分析结果显示,SDRy蛋白被洗脱下来,进一步验证了二者是蛋白质相互作用组;4)共转化结果显示TetR作用下3,17β-HSD表达降低0.77倍;LuxR作用下3,17β-HSD表达降低0.75倍;Lys R调控作用不明显。TetR作用下3α-HSD表达量提高了3.58倍;Lys R作用下3α-HSD表达量升高5.61倍;LuxR作用不明显。这些结果为研究C.T.菌中参与激素降解的蛋白质间的相互作用组提供了实验基础。