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当机体受到应激刺激时,下丘脑-垂体-肾上腺即HPA轴激活,最终由肾上腺皮质释放大量的糖皮质激素,维持内环境稳态。然而在一些伤害性刺激如脓毒症的情况下,机体会出现肾上腺皮质反应性低下。进一步统计发现,肾上腺皮质反应性低下的患者预后也较差。然而关于肾上腺皮质反应性低下的机制至今仍未完全阐明。缺氧是临床各种疾病中常见的一类病理过程,本实验室前期实验过程中发现,缺氧后的小鼠对麻醉剂的耐受力显著降低。那么缺氧是否使得肾上腺皮质反应性降低,进而使得机体对伤害性刺激的抵御能力显著下降呢?硫化氢（hydrogen sulfide,H2S）是近年来发现的第三种气体信号分子,已有大量文献报道H2S在多种生理病理过程中发挥重要作用。本实验室前期研究发现,小鼠肾上腺组织中,H2S可以通过改善线粒体功能进而提高内毒素血症小鼠肾上腺皮质反应性。那么H2S是否参与缺氧诱导的肾上腺皮质反应性低下呢?其相关机制又是怎样的呢?因此,本课题将围绕缺氧与肾上腺皮质反应性的关系以及H2S在这一过程中发挥的作用展开研究,通过ACTH刺激实验检测小鼠肾上腺皮质反应性,并通过Western Blot检测相关蛋白的表达,探究这一过程的机制。由于在体实验局限性,本课题通过体外培养Y1细胞完成部分研究。通过研究缺氧状态下肾上腺皮质反应性及其相关机制,可以为高原及缺氧状态下提高肾上腺皮质反应性、提高机体对于外界应激刺激的抵御能力提供理论基础,并为临床治疗肾上腺皮质反应性低下提供新的思路。在第一部分研究中,本课题发现缺氧后小鼠肾上腺组织中CTH表达减少。由于肾上腺皮质束状带是机体生成糖皮质激素的主要部位,为了可以特异地研究肾上腺皮质中束状带中特定的基因或蛋白在相关疾病中所发挥的作用,本课题进行了第二部分的研究,构建肾上腺皮质束状带特异性表达Cre重组酶转基因小鼠。本课题首先筛选出特异性表达在肾上腺皮质束状带的基因CYP11B1,并在其终止密码子位点定点敲入2A-Gfp Cre表达框,构建了肾上腺皮质束状带特异性表达Cre重组酶转基因小鼠,并通过免疫荧光、m Tm G、Lac Z染色及Western Blot等实验方法验证该转基因小鼠的构建成功,为肾上腺皮质束状带相关研究提供了有力的研究工具。主要实验结果如下:第一部分硫化氢在缺氧导致的肾上腺皮质功能不全中的作用及其机制一、缺氧通过诱导细胞凋亡及焦亡,引起肾上腺皮质反应性降低,导致机体对应激刺激的抵御能力减弱1.在常氧环境下及缺氧箱中饲养一天或者三天后的小鼠,通过ACTH刺激实验检测肾上腺皮质反应性。结果表明表明,缺氧后小鼠在ACTH刺激下糖皮质激素升幅降低,表明缺氧引起小鼠肾上腺皮质反应性低下;2.在常氧及缺氧箱中各饲养一组假手术组及肾上腺摘除（ADX）组小鼠,按照15mg/kg的剂量腹腔注射LPS。ADX组小鼠死亡率显著高于假手术组,且缺氧情况下的死亡率显著高于常氧情况;3.在常氧环境下及缺氧箱中饲养一天或者三天后的小鼠,取肾上腺组织进行HE染色、Tunel染色并检测焦亡相关指标。缺氧一天或三天后,小鼠肾上腺组织皮质厚度显著降低,出现细胞凋亡,焦亡水平升高。二、硫化氢可能通过抑制NLRP3激活进而改善缺氧引起的肾上腺皮质反应性低下1.将小鼠在常氧或缺氧箱中饲养一天或三天后,小鼠肾上腺组织中CTH表达下调;2.将小鼠分为三组,分别为常氧组、缺氧组和缺氧加GYY4137组。缺氧组在缺氧箱中饲养3天,缺氧加GYY4137组在缺氧组基础上每天以50mg/kg的剂量腹腔注射H2S缓释供体GYY4137,三天后取肾上腺组织,进行HE染色、Tunel染色并检测相关指标。GYY4137可以逆转缺氧引起的肾上腺皮质厚度降低、细胞凋亡,并改善缺氧引起的焦亡水平升高;3.缺氧后NLRP3及Caspase-1成熟体表达显著上调,并且GYY4137可以逆转这一现象。三、缺氧引起肾上腺皮质CTH表达下调,PSMA7硫巯基化水平降低,导致MAVS蓄积,NLRP3及Caspase-1激活。硫化氢供体GYY4137可以改善缺氧引起的相关变化1.通过生物素标签法检测蛋白硫巯基化修饰水平,结果发现,缺氧后肾上腺组织中PSMA7硫巯基化水平显著降低,而GYY4137可以逆转这一现象;2.Co-IP结果表明,在肾上腺组织中PSMA7与MAVS蛋白存在相互作用;3.Western结果显示,肾上腺组织中,缺氧可以引起的MAVS、NLRP3及Caspase-1成熟体表达上调,而GYY4137可以显著改善这些蛋白水平变化。四、PSMA7蛋白70位点半胱氨酸的硫巯基化修饰在其功能维持中发挥重要作用1.应用硫巯基化抑制剂碘乙酰胺（IAA）处理Y1细胞,阻断所有位点硫巯基化修饰。Western Blot结果显示,Y1细胞中NLRP3表达上调;2.用突变质粒转染Y1细胞,使相应位点不能发生硫巯基化修饰,Western Blot结果显示,70位点半胱氨酸突变后Y1细胞中NLRP3表达上调。第二部分肾上腺皮质束状带特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的构建一、CYP11B1特异性表达在肾上腺皮质束状带CYP11B1蛋白特异性表达在肾上腺皮质束状带,肾上腺皮质球状带、网状带及髓质中无表达。二、m Tm G及Lac Z染色检测Cre重组酶表达1.将CYP11B1Cre小鼠与Rosa26 m Tm G工具鼠交配,鉴定得到Cre及m Tm G双阳性子代小鼠,取肾上腺及其他主要脏器组织检测荧光表达。荧光检测发现,肾上腺皮质束状带表达绿色荧光,其余部位及其他脏器组织均表达红色荧光;2.将CYP11B1Cre小鼠与Rosa26 Lac Z工具鼠交配,鉴定得到Cre及Lac Z双阳性子代小鼠。取肾上腺及其他主要脏器组织进行Lac Z染色。结果显示,肾上腺皮质束状带呈蓝色,其余部位及其他脏器组织无蓝色。三、CYP11B1Cre可以特异性敲除肾上腺皮质束状带蛋白表达1.CTHf/f小鼠与野生型小鼠肾上腺组织中CTH蛋白水平无明显差异,而CTH/f/CYP11B1Cre小鼠肾上腺组织中CTH蛋白水平明显降低,CTHf/fCYP11B1Cre小鼠肾上腺组织中几乎没有CTH蛋白表达;2.CTHf/f肾上腺皮质有较多的CTH表达,而CTHf/f/CYP11B1Cre小鼠肾上腺组织中,肾上腺皮质中CTH阳性着色显著减少,尤其是肾上腺皮质束状带未见明显的荧光着色。结论第一部分中,本课题发现缺氧引起肾上腺组织中H2S生成酶CTH表达减少,导致PSMA7蛋白硫巯基化水平降低,导致MAVS蓄积,进而激活NLRP3、Caspase-1,引起炎症反应,导致肾上腺皮质反应性降低。H2S供体GYY4137可以恢复PSMA7硫巯基化水平,进而抑制下游通路激活,维持肾上腺皮质反应性。为了研究相关蛋白在肾上腺皮质中的功能作用,本课题开展了第二部分研究。本课题以CYP11B1基因为靶点,构建了肾上腺皮质束状带特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠,并通过多种方法验证转基因小鼠构建成功。