乳腺生物反应器(mammary gland bioreactors)生产药用蛋白具有活性高,成本低,分离纯化简单等优点,因此已成为生物技术研究的热点。乳腺特异性表达载体构建的合理性和有效性是乳腺生物反应器成功的基础和关键。因此,建立一个快速检测系统来评价构建载体的合理性,对于提高乳腺生物反应器研制效率具有非常重要的意义。利用体细胞核移植方法生产转基因动物具有许多不可比拟的优点,其中最主要的优点是:可在细胞水平检测外源基因的整合与表达,提高转基因动物的阳性率,降低转基因动物生产成本。因此,利用细胞转基因技术与体细胞克隆技术相结合制备乳腺生物反应器成为目前生物领域的研究热点。本研究主要利用绿色荧光蛋白基因作为报告基因开展乳腺生物反应器的基础研究。研究内容主要包括:双选择标记载体的构建,山羊胎儿成纤维细胞的分离培养及其生物学特性研究,脂质体法转染山羊胎儿成纤维细胞体系的优化及转基因细胞系的建立,山羊乳腺细胞的培养及其表达乳腺特异性载体BLG-EGFP 的研究。首先,利用内部核糖体进入位点(IRES)构建同时表达绿色荧光蛋白(EGFP)和新霉素抗性基因(Neo)的双选择标记载体,使两个基因在共同的启动子引导下独立地进行表达,该载体在转基因细胞筛选和基因表达研究中应用广泛。其次,应用组织块培养法从妊娠90 d 左右的山羊胎儿中成功分离出成纤维细胞,命名为GFF。对培养细胞进行形态学观察、贴壁率、生长曲线测定、克隆形成率、染色体和周期等生物学特性分析,结果表明培养细胞具有正常的形态和生长特性,染色体核型正常率在87.04﹪,为体细胞转基因研究提供良好的供体细胞。同时,以双选择标记载体为外源基因,采用脂质体介导法转染山羊胎儿成纤维细胞,验证双选择标记载体的有效性。通过比较不同细胞汇合度、DNA 剂量、脂质体与DNA 比例、载体形态及血清对转染效率的影响,进行转染条件的