第一部分:长链非编码RNA SNHG3在肝细胞肝癌中作用机制的研究研究背景肝癌由于每年约84万新确诊病例和74万死亡病例成为肿瘤致死的主要元凶之一,其中肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)约占 85%-90%。肝癌的病因多种,包括酗酒,黄曲霉毒素污染饮食,肝炎病毒感染等。根据全球癌症研究署报告,引起肝癌的病因分布具有地域性差异,在我国HCC主要与慢性乙型肝炎病毒感染引起的慢性乙型肝炎有关。在乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染过程中,肝细胞长期受到炎症刺激可出现肝硬化(Liver cirrhosis,LC)和HCC,被称为慢性HBV感染“三部曲”。HCC起病隐匿,恶性程度高,进展迅速,预后极差。近年来,针对HCC的治疗方法发展迅速,包括全身化疗,射频消融,微波消融,但是HCC晚期患者预后仍不理想。根据以往的研究报道,HCC的发生发展是一个极其复杂的过程,可涉及到多种基因以及信号通路异常。因此,研究HCC发生发展的分子机制,寻找和探索治疗HCC新靶点显得尤为重要。长非编码 RNA(long non-coding RNA,LncRNA)是长度大于 200nt,不具有蛋白质编码功能的RNA。大量实验研究表明LncRNAs在肿瘤的发生发展中发挥了重要作用,可以影响肿瘤进展中的许多生物学功能,包括上皮-间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)、侵袭、转移、增殖、凋亡和药物抗性。有研究报道 lncRNA-小核仁 RNA 宿主基因 3(Small nucleolar RNA host gene 3,SNHG3)可参与恶性肿瘤发生发展过程中。SNHG3在多种恶性肿瘤内表达异常并且与疾病进展相关,比如结直肠癌、肺腺癌和神经胶质瘤。SNHG3表达异常还与恶性肿瘤预后相关,比如SNHG3在卵巢癌中表达增加常预示卵巢癌预后不良。SNHG3在HCC中表达升高并且在HCC进展过程中发挥作用,但是SNHG3在HCC中确切的分子机制尚不清楚。因此,进一步研究SNHG3的作用机制判断SNHG3是否可以作为新的治疗靶点十分重要。MicroRNA(miRNA)属于高度保守的小非编码RNA,其在恶性肿瘤中的生物学作用得到广泛认可,包括细胞增殖,侵袭,凋亡,代谢和信号转导。据报道,miRNA-326(miR-326)参与细胞凋亡、侵袭,胚胎发育,肿瘤生长,免疫调节,化疗药物抗药性和肿瘤发生。MiR-326在神经胶质瘤,子宫内膜癌和宫颈癌中通过靶向不同的mRNA起到肿瘤抑制剂的作用。MiR-326在HCC中低表达,并且可以促进细胞凋亡,抑制细胞侵袭和肿瘤生长。研究报道许多lncRNA作为竞争性内源RNA(competitive endogenous RNAs,ceRNA)可以通过 microRNA 反应元件(microRNA response element,MRE)竞争性地结合miRNA,从而降低miRNA对靶mRNA的抑制作用。即miRNA可以通过结合mRNA导致基因沉默,而lncRNA可以作为ceRNA与mRNA竞争结合miRNA,从而抑制miRNA导致的基因沉默。然而,目前SNHG3和miR-326在HCC中的关系还没有研究报道。研究目的1.明确SNHG3在慢性乙型肝炎、肝硬化和肝细胞肝癌患者外周血单个核细胞中的表达规律。2.明确SNHG3在肝细胞肝癌组织标本和肝癌细胞中的表达规律,分析肝细胞肝癌组织标本中SNHG3表达水平与临床病理参数之间的相关性。3.寻找SNHG3可以结合的miRNA。4.明确SNHG3作为miR-326的ceRNA发挥生物学功能。5.明确SNHG3对于miR-326的靶mRNASMAD3的调控。6.明确SNHG3可能通过SMAD3及其下游基因ZEB1信号通路发挥生物学功能。研究方法1.检测SNHG3在患者外周血单个核细胞中的表达情况本研究自2016年5月至2017年12月期间,在山东大学齐鲁医院肝病科住院病人中收集了 124例患者外周静脉血,其中30例慢性乙型肝炎患者、30例肝硬化患者、40例肝细胞肝癌患者以及24例健康志愿者作为对照。通过提取研究对象的外周血单个核细胞,利用qRT-PCR检测外周血单个核细胞中SNHG3表达水平。2.检测SNHG3在HCC组织标本和肝癌细胞系中的表达情况在2017年8月到2018年1月期间,我们在山东大学齐鲁医院手术患者中收集47对HCC患者肿瘤组织和癌旁对照组织。利用qRT-PCR检测47对肝细胞肝癌肿瘤组织标本和癌旁对照组织标本中SNHG3表达水平,再利用统计学方法分析肿瘤组织中SNHG3表达水平与患者临床病理参数的相关性。利用qRT-PCR检测正常肝细胞L02、肝癌细胞系HepG2细胞和HCCLM3细胞中SNHG3表达水平。3.寻找SNHG3相结合的miRNA及其检测其表达水平生物信息学软件预测可能与SNHG3结合的miRNA,利用双荧光素酶基因报告实验检测SNHG3与miR-326可以相互结合。利用qRT-PCR检测47对肝细胞肝癌肿瘤组织标本和癌旁对照组织标本中miR-326表达水平。利用Pearson correlation分析肝细胞肝癌组织标本中SNHG3与miR-326表达水平之间的关系。利用qRT-PCR检测正常肝细胞L02、肝癌细胞系HepG2细胞和HCCLM3细胞中miR-326表达水平。4.检测SNHG3作为miR-326的ceRNA对细胞生物学功能的影响在肝癌细胞中分别转染小干扰RNA si-SNHG3,共转染si-SNHG3和miR-326 mimic、感染慢病毒 pLVX-SNHG3、共转染 pLVX-SNHG3 和 miR-326 inhibitor,利用MTT、Transwell、流式细胞术、qRT-PCR和western blot分别检测干扰和过表达SNHG3对细胞增殖、迁移、凋亡和EMT的影响以及检测miR-326过表达和低表达对SNHG3细胞生物学功能的影响。5.检测 SNHG3 对 miR-326 靶 mRNA SMAD3 的调控5.1 检测 miR-326 的靶 mRNA利用生物信息学软件预测miR-326的靶mRNA,利用双荧光素酶基因报告实验检测miR-326是否对SMAD3具有调节作用;利用qRT-PCR和western blot检测SMAD3在47对肝细胞肝癌肿瘤组织和癌旁对照组织中的表达水平,以及在正常肝细胞L02、肝癌细胞系HepG2细胞和HCCLM3细胞中的表达水平;在肝癌细胞中分别转染miR-326 mimic和miR-326 inhibitor,利用qRT-PCR和western blot检测过表达或者干扰miR-326对SMAD3 mRNA和蛋白表达水平的影响。5.2检测SNHG3通过吸附miR-326调控SMAD3在肝癌细胞中感染pLVX-SNHG3慢病毒、共转染pLVX-SNHG3和miR-326 mimic、转染 si-SNHG3 和共转染 si-SNHG3 和 miR-326 inhibitor,利用 qRT-PCR和western blot检测过表达和干扰SNHG3对SMAD3表达水平的影响以及SNHG3和miR-326相互结合后对SMAD3表达水平的影响6.检测SNHG3可能通过SMAD3及其下游基因ZEB1信号通路发挥生物学作用6.1检测ZEB1在组织标本和肝癌细胞系中的表达情况利用qRT-PCR检测ZEB1在47对肝细胞肝癌肿瘤组织和癌旁对照组织中的表达水平;利用qRT-PCR和western blot检测ZEB1在正常肝细胞L02、肝癌细胞系HepG2细胞和HCCLM3细胞中的表达水平。6.2检测SNHG3调控ZEB1表达在肝癌细胞中转染pLVX-SNHG3或者转染si-SNHG3,利用qRT-PCR和western blot检测过表达和干扰SNHG3对SMAD3下游基因ZEB1 mRNA和蛋白表达水平的影响。6.3检测SNHG3通过ZEB1发挥生物学功能在肝癌细胞中感染pLVX-SNHG3慢病毒,共转染pLVX-SNHG3和si-ZEB1、转染si-SNHG3、共转染si-SNHG3和pLVX-ZEB1,利用MTT检测干扰和过表达ZEB1是否影响SNHG3对细胞增殖的作用,利用western blot检测干扰ZEB1是否影响SNHG3对细胞EMT的作用。6.4体内实验检测SNHG3作为miR-326的ceRNA可能通过SMAD3及其下游基因ZEB1信号通路发挥作用构建SNHG3干扰的肝癌细胞进行裸鼠皮下种植瘤实验,测量皮下种植瘤的大小,33天后解剖小鼠,观察裸鼠皮下种植瘤的生长状态。对小鼠皮下原位种植瘤组织切片进行Ki-67染色和Tunel染色,检测在体内干扰SNHG3对于细胞增殖和凋亡的影响,利用western blot检测SNHG3在体内对EMT的影响以及对于SMAD3和ZEB1蛋白表达水平的影响。研究结果1.SNHG3在研究对象外周血单个核细胞中的表达情况SNHG3在肝细胞肝癌患者外周血单个核细胞中的表达水平显著高于慢性乙型肝炎、肝硬化和健康对照组。SNHG3在慢性乙型肝炎、肝硬化和健康对照组外周血单个核细胞中的表达水平无明显差异。2.SNHG3在HCC组织标本中和肝癌细胞系中的表达情况SNHG3在肝细胞肝癌肿瘤组织中的表达水平明显高于癌旁对照组织,卡方检验显示SNHG3的表达水平与TNM分期、有无淋巴结转移和远处转移相关,与年龄、性别无明显相关性。SNHG3在肝癌细胞系HepG2细胞和HCCLM3细胞中的表达水平明显高于正常肝细胞L02。3.SNHG3可以与miR-326相互结合及其miR-326的表达水平通过生物信息软件分析有16个miRNAs具有与SNHG3相互结合的序列,经查阅Pubmed发现miR-326在肝细胞肝癌中低表达并且和预后相关;双荧光素酶基因报告实验显示miR-326 mimic抑制SNHG3-WT载体的荧光素酶活性,但是对SNHG3-MUT的荧光素酶活性没有明显影响。MiR-326在肝细胞肝癌组织中表达水平明显高于癌旁对照组织,Pearson correlation分析在肝细胞肝癌组织中SNHG3与miR-326表达水平呈负相关。MiR-326在肝癌细胞系HepG2细胞和HCCLM3细胞中的表达水平明显低于正常肝细胞L02。4.SNHG3作为miR-326的ceRNA促进细胞增殖、迁移、EMT和抑制凋亡干扰SNHG3肝癌细胞增殖、迁移、EMT能力降低但是细胞凋亡能力升高,miR-326 inhibitor(anti-326)抑制SNHG3低表达产生的上述细胞生物学功能;过表达SNHG3肝癌细胞增殖、迁移、EMT能力升高但是细胞凋亡数量降低,miR-326 mimic抑制SNHG3过表达产生的上述细胞生物学功能。5.SNHG3 调控 miR-326 的靶 mRNA SMAD3 的表达5.1 miR-326 抑制靶 mRNA SMAD3 的表达生物信息学软件分析SMAD3是具有与miR-326具有相互结合序列的mRNA,双荧光素酶基因报告实验证实miR-326 mimic抑制SMAD3-WT载体的荧光素酶活性,但是对SMAD3-MUT的荧光素酶活性没有明显影响;QRT-PCR结果显示SMAD3在47例肝细胞癌肿瘤组织标本的表达水平明显高于癌旁对照组织;QRT-PCR和western blot结果显示SAMD3在肝癌细胞系HepG2细胞和HCCLM3细胞中的表达水平明显高于正常肝细胞L02;QRT-PCR和western blot结果显示miR-326过表达则SMAD3 mRNA和蛋白的表达降低,抑制miR-326则SMAD3 mRNA和蛋白的表达升高。5.2 SNHG3通过吸附miR-326促进SMAD3表达SNHG3过表达则SMAD3表达升高,共转染miR-326mimic则SMAD3表达下降;干扰SNHG3则SMAD3表达降低,共转染miR-326 inhibitor则SMAD3表达升高。6.SNHG3通过SMAD3及其下游基因ZEB1发挥生物学功能6.1 ZEB1在组织标本和肝癌细胞系中的表达ZEB1在47例肝细胞癌肿瘤组织标本的表达水平明显高于癌旁对照组织,在肝癌细胞系HepG2细胞和HCCLM3细胞中的表达水平明显高于正常肝细胞L02。6.2 SNHG3促进ZEB1表达干扰SNHG3可以降低ZEB1 mRNA和蛋白的表达水平,过表达SNHG3可以升高ZEB1 mRNA和蛋白的表达水平。6.3 SNHG3通过ZEB1促进细胞增殖和EMT过表达SNHG3肝癌细胞增殖能力和EMT能力增加,同时干扰ZEB1则抑制SNHG3过表达导致的细胞增殖能力和EMT改变;干扰SNHG3则肝癌细胞增殖能力和EMT能力降低,同时过表达ZEB1则抑制SNHG3低表达导致的细胞增殖能力和EMT改变。6.4体内实验证实SNHG3可能通过SMAD3及其下游基因ZEB1发挥生物学功能干扰SNHG3可以抑制裸鼠皮下原位种植瘤的生长。对裸鼠皮下原位种植瘤组织切片染色,Ki-67染色程度明显降低,Tunel染色程度明显升高,western blot结果显示细胞EMT降低。此外,干扰SNHG3则SMAD3和ZEB1在蛋白水平的表达降低。研究结论在本实验中,我们发现SNHG3的表达水平在HCC患者外周血单核细胞、肝细胞肝癌组织和肝癌细胞系中明显升高,并且与患者TNM分期、有无淋巴结转移和远处转移相关。SNHG3具有与miR-326结合位点并且可以相互结合,此外SNHG3与miR-326的表达水平呈现负相关。SNHG3作为miR-326的ceRNA可以促进肝癌细胞增殖、迁移、EMT和抑制凋亡,miR-326抑制SNHG3的上述细胞生物学功能。MiR-326抑制靶mRNA SMAD3的表达,SNHG3通过吸附miR-326促进SMAD3表达。SNHG3通过调节SMAD3的下游基因ZEB1的表达进一步影响肝癌细胞的生物学效应。总之,SNHG3作为miR-326的竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)促进 SMAD3 及其下游基因 ZEB1的表达,进而促进肝癌细胞增殖、迁移、EMT和抑制凋亡。第二部分:长链非编码RNA SNHG3通过NLRP3影响慢加急性乙型肝炎肝衰竭预后研究背景慢加急性乙型肝炎肝衰竭(Acute-on-chronic hepatitis B liver failure,ACHBLF)是在慢性乙型肝炎进展过程中,由于某些急性损伤导致部分患者在短时间内出现肝功能迅速恶化,以黄疸,凝血障碍为主要临床表现,并在四周内出现腹水和/或肝性脑病等症状。ACHBLF可以发生在慢性HBV感染的任何阶段,进展迅速,由于缺乏有效的临床治疗方法ACHBLF死亡率高达50%-90%。目前,国际上约有20多种关于评估肝衰竭预后的方法,其中终末期肝病积分(Model for end-stage liver disease,MELD)是最常用的关于肝衰竭预后的评估方法,由于导致肝衰竭的因素差异,MELD对于ACHBLF预后的评估不甚理想。因此,寻找更加有效的ACHBLF预后评估方法具有重要意义。慢加急性乙型肝炎肝衰竭在不同时相经历三重打击,包括免疫损伤,缺血缺氧性损伤和内毒素血症。在肝衰竭的发生过程中,炎症因子介导的免疫损伤起了重要作用。细胞因子失衡作为已知的ACHBLF病理机制越来越得到大家的重视,由于HBV感染和细胞毒效应介导的免疫紊乱,通过细胞因子失衡进一步促进ACHBLF的进展。此外,在肝衰竭发展过程中会出现肾上腺功能不全,因此早期利用糖皮质激素成为治疗早期慢加急性乙型肝炎肝衰竭的方法之一。糖皮质激素可以通过保护细胞膜,溶酶体酶和线粒体来防止肝细胞坏死和进行性急性恶化。糖皮质激素是一把双刃剑,正确应用可以极大提高患者的生存率。然而,在ACHBLF患者中使用糖皮质激素是否对细胞因子失衡产生影响尚且没有研究。在之前的研究中我们证实了 lncRNA SNHG3与miR-326在肝细胞肝癌中可以通过SMAD3信号通路促进肝细胞肝癌进展,然而miR-326还可以作为关键的促炎因子通过核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)信号通路参与多种炎症过程。NF-κB作为重要的转录因子可以调节NLRP3的表达。NLRP3(Nucleotide-binding oligomerisation domain-like receptors(NLRs)Family Pyrin Domain Containing 3)属于NLRs蛋白家族,被激活后通过活化caspase-1使细胞因子白介素1β前体(pro-interleukin(IL)-1β,pro-IL-1β)和白介素18前体(pro-interleukin(IL)-18,pro-IL-18)变为有活性的 IL-1β 和 IL-18。IL-1β 和 IL-18作为重要的促炎性分子,其表达紊乱可以导致细胞因子失衡。目前lncRNA SNHG3与miR-326在ACHBLF中的表达状态以及NLRP3与ACHBLF之间的关系尚不清楚。因此本研究首先检测SNHG3和miR-326在ACHBLF患者中的表达水平,再检测促炎性细胞因子IL-1β和IL-18和NLRP3的表达状态,接着分析糖皮质激素对于促炎性细胞因子IL-1β和IL-18和NLRP3表达的影响以及与预后的关系。研究目的1.明确 SNHG3 和 miR-326 在 ACHBLF 患者、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者和健康对照者(healthy controls,HCs)外周血单个核细胞中的表达规律。2.明确促炎性细胞因子IL-1β和IL-18在ACHBLF患者、CHB患者和HCs血浆和外周血单个核细胞中的表达规律。3.明确NLRP3在ACHBLF患者、CHB患者和HCs表达规律及与ACHBLF患者临床数据的相关性。4.研究糖皮质激素对于IL-1β和IL-18和NLRP3表达的影响。研究方法1.利用 qRT-PCR 检测 SNHG3 和 miR-326 在 ACHBLF 患者、CHB 患者和 HCs外周血单个核细胞中的表达规律。2.利用ELISA和qRT-PCR检测ACHBLF患者、CHB患者和HCs血浆和外周血单个核细胞中促炎性细胞因子IL-1β和IL-18的表达情况。3.利用qRT-PCR检测NLRP3在ACHBLF患者、CHB患者和HCs外周血单个核细胞中的表达规律,利用Spearman线性相关分析NLRP3 mRNA水平与相关临床指标之间的关系。4.对接受28天糖皮质激素治疗的ACHBLF患者进行3个月随访,根据患者的生存状况分为生存组和死亡组。通过qRT-PCR检测两组患者外周血单个核细胞中NLRP3及其相关因子在接受糖皮质激素治疗过程中第7天和第28天的表达情况。研究结果1.SNHG3在ACHBLF患者外周血单个核细胞中的表达水平明显低于CHB患者和HCs;miR-326在ACHBLF患者外周血单个核细胞中的表达水平明显高于CHB和HCs患者。即在ACHBLF中,SNHG3表达降低对于miR-326的吸附作用下降。2.促炎性细胞因子IL-1β和IL-18在ACHBLF患者血浆和外周血单个核细胞中的表达水平明显高于CHB患者和HCs。3.NLRP3 mRNA在ACHBLF患者外周血单个核细胞中的表达水平明显高于CHB 患者和 HCs,并且与总胆红素(Total bilirubin,TBIL)、MELD 评分(model for end-stage liver disease)呈正相关,与凝血酶原活动度(prothrombin activity,PTA)、白蛋白(Albumin,ALB)呈负相关,与谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)、肌酐(Creatinine,Cr)无明显相关性。4.在接受糖皮质激素治疗的第7天和第28天,ACHBLF患者生存组外周血单个核细胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18的表达水平明显低于死亡组。在接受糖皮质激素治疗的第7天和第28天,生存组TBIL和PTA也明显低于死亡组。此外,ACHBLF患者生存组外周血单个核细胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18在接受糖皮质激素治疗过程中表达水平呈持续性下降,死亡组则无明显改变甚至有升高的表达趋势。研究结论LncRNA SNHG3在ACHBLF患者外周血单个核细胞中表达下降,而其可以结合的miR-326则表达升高。在ACHBLF中miR-326可能通过NF-κB信号通路使NLRP3及其对应的促炎性细胞因子表达升高并且与患者的临床严重程度呈正相关。此外,糖皮质激素通过调节NLRP3表达水平影响ACHBLF预后。