论文部分内容阅读
目的:缺血性脑卒中是一类严重危害人类身体健康的心脑血管疾病。目前尚缺乏能有效防治该病的药物。5,6,7,4′-四羟基异黄酮-5′-磺酸钠（YCL）是在中药川射干有效成分射干苷元基础上合成的化合物,本研究拟通过相关实验评价其对缺血性脑卒的作用及其作用机理,以期发现一个能有效防治缺血性脑卒中的创新药物。方法:1、中药射干抗脑卒中有效成分筛选研究:将待筛选川产道地药材射干中分离出来的黄酮类成分单体化合物-14、18和35号化合物,选择H2O2损伤的PC12细胞作为本实验的氧化损伤模型,通过3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）实验,建立H2O2氧化损伤模型,确定H2O2的作用浓度以及作用时间,再通过乳酸脱氢酶（LDH）和MTT实验,验证待选化合物是否对H2O2损伤的PC12细胞具有保护作用;最后通过体外对乙酰胆碱酶和对丁酰胆碱酶活性检测,筛选化合物是否有体外抗乙酰胆碱酶和对丁酰胆碱酶活性能力。2、YCL在大鼠体内的药物动力学研究:采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用方法（UPLC-QQQ-MS）技术,检测大鼠腹腔注射YCL200mg·kg-1后不同时间点血浆及脑组织YCL原型成分、其主要代谢物水平及其动力学参数。3、5,6,7,4′-四羟基异黄酮-5′-磺酸钠（YCL）防治缺血性脑卒中作用研究:1)选择雄性SD大鼠,通过线栓法复制大脑中动脉阻塞（MCAO）再灌注大鼠模型,按神经功能缺损评分标准和氯化三苯四氮唑（TTC）染色法评价大鼠行为学和梗死面积;腹主动脉取血测定生化指标超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、还原性谷胱甘肽（GSH）及一氧化氮（NO）活性,以及对大鼠脑组织的病理学观察来进一步评价YCL防治大鼠缺血性脑卒中（CIS）的作用;2)选择雄性KM小鼠,通过小鼠急性脑缺血缺氧实验模型-小鼠断头实验的行为学和生化指标检测,初步评价YCL防治小鼠急性脑缺血缺氧的作用。4、YCL防治缺血性脑卒中作用机理研究:通过亚硝酸钠中毒致小鼠缺氧损伤模型和记忆力巩固障碍模型初步评价YCL的药理作用;然后通过YCL体外抗氧化实验进一步探索YCL抗缺血性脑卒中的作用机理。结果:1、通过化合物对PC12毒性作用实验发现:14号化合物的安全浓度范围为0-1μg·m L-1,35号化合物安全浓度范围为0-10μg·m L-1,而18号化合物对PC12细胞几乎无抑制作用。MTT法实验发现:当H2O2的浓度为60μmol·L-1,14号化合物药物浓度为0.125μg·m L-1时,能显著提高细胞的存活率,对H2O2损伤的PC12细胞有明显的保护作用;当H2O2的浓度为100μmol·L-1,18号化合物药物浓度为1μg·m L-1、10μg·m L-1和35号化合物药物浓度为0.1μg·m L-1、0.01μg·m L-1时,能显著提高细胞的存活率,对H2O2损伤的PC12细胞有明显的保护作用。最后再通过LDH和MTT法得出,14、18和35号化合物对H2O2引起的细胞损伤都具有一定的保护作用,而都对乙酰胆碱酶和丁酰胆碱酶活性没有作用。总之,体外筛选发现川产道地药材射干中分离出来的黄酮类成分单体化合物-14、18和35号化合物在PC12细胞氧化应激损伤中都具有一定的神经保护作用,其中14号化合物取名为YCL。2、YCL在大鼠体内药代动力学研究结果显示YCL 200 mg·kg-1在大鼠血浆中和脑组织中的Tmax分别是9.167±4.916 min和0.253±0.165 h,t1/2分别是29.42±13.169 min和0.342±0.027 h,CL分别是243.592±88.919 m L/min/kg和1520.988±558.296 m L/h/kg,且发现其主要二相代谢产物为2种葡萄糖醛酸化代谢物。说明YCL在大鼠血浆和脑中呈现吸收快、消除快等特点,有利于其快速入血和入脑发挥药效,同时提示在进行药物的药效学研究时,除了原型化合物,还应该关注代谢物之间相互转化的情况。3、通过MCAO再灌注大鼠模型实验发现,5,6,7,4′-四羟基异黄酮-5′-磺酸钠（YCL）各剂量组减轻了MCAO引起的神经功能缺损、缩小了梗死面积,可提高SOD活力,其中YCL-50和YCL-100组可降低MDA含量。同时YCL-200组可降低脑组织含水量、减轻脑水肿,减轻大脑中动脉闭塞诱导的大鼠大脑病变程度、降低损伤发生率,对大脑中动脉闭塞诱导的大鼠大脑损伤有较好的治疗作用。表明YCL对MCAO模型大鼠的缺血性脑损伤具有改善作用。通过小鼠急性脑缺血缺氧模型—小鼠断头实验发现,YCL不能延长小鼠的呼吸时间,对小鼠急性脑缺血缺氧无明显作用。4、YCL对亚硝酸钠中毒致小鼠缺氧损伤实验发现,YCL不能延长小鼠的呼吸时间;YCL对亚硝酸钠致小鼠记忆力巩固障碍实验发现,YCL-100和YCL-200组潜伏期明显增加,错误次数明显减少,能明显改善小鼠的记忆巩固障碍,其中YCL-200组小鼠脑组织中的GSH含量升高,YCL-100组小鼠脑组织中的MDA活性降低。YCL体外实验表明,YCL的DPPH自由基清除率在0.05 mg·m L-1时可达到80%左右的清除率;YCL在0.25 mg·m L-1时ABTS自由基的清除可达90%左右,且YCL的DPPH和ABTS清除率随浓度增加而呈现升高趋势。综上提示,YCL可改善记忆力障碍,可能主要通过清除自由基的抗氧化作用机制防治缺血性脑卒中,发挥神经保护作用。结论:从川产道地药材射干中分离出来的黄酮类成分单体化合物-14号化合物（YCL）可能主要通过原型和/或代谢物YCL葡萄糖醛酸的直接抗氧化和间接清除自由基的抗氧化作用机制发挥对缺血性脑卒中的神经保护作用,同时YCL在大鼠血浆和脑中呈现吸收快、消除快等特点,有利于其快速入脑发挥药效。