蒎烯(Pinene)是一种重要的天然单萜类平台化合物,被广泛应用于合成高密度可再生燃料、药理活性物、香料和芳香醇等产品,在军事、医药、农业和工业等领域均有重要的应用前景。目前,在工业上大批量获得蒎烯的途径是利用高效精馏塔从脂松节油或粗硫酸盐松节油中进行分离提取。这种传统的获取蒎烯的方法存在效率低、操作复杂繁琐、能源消耗大和设备技术要求高等缺点,与此同时破坏了环境、消耗了大量自然资源。以系统生物学的研究为基础,合成生物学借助工程学的标准化、模块化和系统化的设计理论,以人工合成的脱氧核糖核苷酸为基础,设计并创造器件(devices)、元件(parts)以及模块(motifs),然后利用这些人工合成的“生物零件”对现有自然生物系统(systems)进行改造和优化,或者完全重新合成具有预定功能的全新的人工生物系统,来实现对天然产物、功能材料及新能源的大规模工业化生产和应用。本文以大肠杆菌为底盘细胞,导入外源杂合的蒎烯合成代谢途径,构建了合成蒎烯的“微生物工厂”。研究内容主要分为以下四个部分:(1)通过GenBank获取蒎烯合成代谢途径中最后两个酶:牻牛儿基焦磷酸合成酶(GPPS)、蒎烯合成酶(PS)的基因序列,优化后进行人工全基因合成,合成的目的基因连入载体后命名为pTOPO-GPPS和pTOPO-PS。分别以pETDuet-1和pET-24a载体为基础构建GPPS、PS的共表达载体和融合表达载体,并分别将其转化到大肠杆菌中获得工程菌E.hzh01和E.hzh02。(2)基于GC-MS技术建立了蒎烯的检测方法,利用工程菌E.hzh01和E.hzh02验证GPPS、PS融合表达和共表达产蒎烯的效率及外源蛋白的表达对大肠杆菌生长的影响。结果表明,相较于共表达,蛋白融合表达可以提高蒎烯的产量且更有利于大肠杆菌的生长。(3)通过GenBank获取MVA代谢途径相关酶(mvaE:、mvaS、ERGl2、ERG8、ERG19、IDI)的基因序列,设计引物克隆出目的基因。利用BioBrick原理方法和多顺反子模型的原理方法构建两种不同方案的MVA下游代谢途径。将MVA代谢途径和GPPS、PS融合表达基因共同转化到大肠杆菌中构建完整蒎烯合成代谢工程菌株E.hzh03、E.hzh05。摇瓶培养工程菌并检测蒎烯产量,E.hzh03和E.hzh05蒎烯产量分别为6.32 mg/L和19.26 mg/L。结果表明,将MVA代谢途径导入到大肠杆菌中可以显著提高蒎烯的产率;相比较于BioBrick原理方法构建的MVA代谢途径产蒎烯工程菌株,利用多顺反子模型构建的MVA代谢途径工程菌株的合成蒎烯能力更强。(4)对基因mvaS进行点突变可以提高MVA途径的效率,在E.hzh03、E.hzh05的基础上构建了 mvaS突变菌株E.hzh04和E.hzh06。摇瓶培养工程菌并检测蒎烯产量,mvaS突变菌株的产蒎烯能力较突变前并没有明显提高。结果表明:基因mvaS点突变并对蒎烯产量的提高并没有显著的意义。(5)利用CRISPR/Cas9技术将来源于酵母和粪肠球菌的外源杂合MVA代谢途径的基因分两次定点整合到大肠杆菌基因组中,成功构建了 MVA代谢途径组成型表达的大肠杆菌。本文利用合成生物学的思想理念,将来源于酵母和粪肠球菌的异源杂合MVA代谢途径和来源于北美巨冷杉(Abies grandis)的牻牛儿焦磷酸合成酶和蒎烯合成酶基因共同导入大肠杆菌中并诱导表达,构建含完整的蒎烯代谢途径的大肠杆菌工程菌,评价了不同表达模式下大肠杆菌工程菌产蒎烯的能力,为工业生物合成蒎烯奠定了基础。再将优化好的MVA代谢途径通过CRISPR/Cas9技术定点整合到大肠杆菌基因组中,使其能在大肠杆菌中组成型表达,降低了外源基因在大肠杆菌中的表达压力。此外,成功构建的组成型表达MVA代谢途径的工程菌,可作为一种底盘细胞,广泛用于合成萜类化合物。