论文部分内容阅读
沙门氏菌是最常见的食源性疾病病源体。控制沙门氏菌感染的有效措施之一,是将食品和临床标本中的致病菌快速而准确地检测出来,以便及时采取应对措施。由于沙门氏菌传统检测方法的诸多局限性,研发操作简便、结果可靠、成本低廉、快速高效的检测新方法备受国内外学者关注。另一类严重威胁人类身体健康的致病微生物是流感病毒,由它引起的流感是最严重的传染病之一。流感的治疗通常采用M2离子通道阻滞剂和神经氨酸酶抑制剂,但流感病毒的快速变异催生了越来越多的耐药毒株,致使常规药物的疗效不断降低。因此,揭示新的药物作用机制、开发新型防治药物是流感治疗工作中亟待解决的问题。鉴于此,我们试图以核酸适配体为工具,针对几种当前给人类健康带来巨大威胁的病原微生物建立一个快速高效的检测和防治平台。围绕这一主题,本研究以鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、甲型副伤寒沙门氏菌(S.paratyphi A)鞭毛蛋白和H1N1流感病毒血凝素(H1N1-HA)为实验材料,开展了以下几方面的工作:1、通过Cell-SELEX筛选S.typhimurium核酸适配体。以S.typhimurium菌体作为Cell-SELEX的靶标,筛选出6条DNA适配体,亲和力和特异性鉴定结果显示,它们的解离常数(Kd值)均小于100 nM,其中StmApt 6亲和力最高,Kd值为30±4n M,且在S.typhimurium以及一些其他的菌种如猪霍乱沙门氏菌(S.choleraesuis)、甲型副伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌(S.aureus)和大肠杆菌(E.Col)K88之间有着良好的区分度。2、通过常规SELEX技术筛选S.paratyphi A鞭毛蛋白和H1N1流感病毒HA核酸适配体。以纯化的Sparatyphi A.鞭毛蛋白和纯化的H1N1-HA为靶标,采用常规SELEX技术,筛选出了 4条S.paratykphi A鞭毛蛋白的DNA适配体和2条H1N1-HA的DNA适配体,亲和力鉴定结果显示,它们的Kd值均小于100 nM,其中分别以鞭毛蛋白适配体FlagApt 3和HA蛋白适配体HaApt 1的亲和力最高,其Kd值分别为27±27nM和78±1nM。3、采用核酸适配体和氧化石墨烯构建S.typhimurium检测系统。将上述StmApt 6的5’端以FAM作修饰,再与氧化石墨烯非共价结合,构建了一个基于碳纳米材料的荧光适配体传感器。该传感器可以快速有效地对S.typhimurium进行检测,在理想的实验条件下,其灵敏度可达到100 CFU/mL,线性范围为103～108CFU/mL,以牛奶为实际样品对该系统进行性能检验,结果显示该系统对牛奶中的靶菌仍有着良好的反应性,提示它对食品中S.typhimurium的定性和定量检测有着一定的实际应用价值。4、采用核酸适配体和单壁碳纳米管构建S.paratyphiJ检测系统。将上述FlagApt 3去除部分固定序列后,在其5’端以FITC作修饰,3’端共价连接一段DNA酶序列,制成一个带荧光素的分子探针,然后将其与碳纳米管非共价结合,构建了一个双重信号检测系统。样品中S.paratyphi A的量可以通过系统检测到的荧光值或吸光度值来求出。利用该系统进行牛奶样品中S.paratyphi A的定量测定,可检出105CFU/mL(荧光法)和106CFU/mL(分光光度法)的目标菌。由于采用两种信号分别对同一目标菌进行检测,该方法大大地减少了假阳性率产生的可能性,使检测结果的准确性与可靠性得到显著提升。5、采用核酸适配体进行抗流感病毒感染的研究。以上述HaApt 1进行红细胞凝集抑制试验和微量中和试验,结果显示,HaApt 1能有效地抑制H1N1(A/Puerto Rico/8/1934)流感病毒所致的红细胞凝集,直接阻止H1N1流感病毒在培养的MDCK细胞上的吸附及对该细胞的感染,使病毒在细胞中的复制显著减少。根据实验结果初步判断,HaApt 1能与H1N1血凝素蛋白关键位点发生紧密结合,阻断病毒与宿主细胞受体之间的相互作用。因此,HaApt 1对于开展流感病毒HA-宿主细胞分子间相互作用的研究,以及抗流感病毒感染药物的开发具有较大的理论研究意义和潜在的实际应用价值。