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多发性硬化症（Multiple sclerosis,MS）是一种中枢神经脱髓鞘疾病,影响着全球数百万人的身体健康,病重者甚至因此瘫痪残疾。实验性自身免疫性脑脊髓炎（Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE）是研究该病的常用模型,能够很好地模拟MS的临床和病理表现。少突胶质细胞（Oligodendrocytes,OLs）是中枢神经的成髓鞘神经胶质细胞,由少突胶质细胞祖细胞（Oligodendrocyte precursor cells,OPCs）分化而来,具有修复髓鞘损伤的作用。鉴于OLs为已分化细胞,细胞增殖能力非常有限,难以满足细胞移植治疗的数量需求,OPCs成为了治疗髓鞘疾病的潜在有效细胞资源。然而,原代OPCs的分离和增殖培养较为困难。采用间接谱系转化技术将自身体细胞重编程成为OPC样的诱导性少突胶质细胞祖细胞（induced oligodendrocyte precursor cells,iOPCs）,可以获得大量的OPCs用于细胞治疗,降低免疫排斥反应,有效避免多能干细胞移植的细胞异质性和致瘤性,比利用诱导性多能干细胞分化获得OPCs的途径更为简单。因此,本试验利用药物诱导建立了小鼠EAE模型,采用间接谱系转化技术将NIH/3T3细胞转化成为iOPCs,并利用microRNA（miRNA）转染iOPCs,体外验证其分化成为成熟iOLs的能力。结合芬戈莫德（FTY720）抑制EAE的病程,改善病变处微环境的功能,通过侧脑室注射移植iOPCs进入EAE小鼠脑内,探究其治疗效果,为脱髓鞘疾病的细胞治疗、药物开发等提供参考。试验一小鼠EAE模型的构建及鉴定小鼠EAE是研究MS发病机理和研发其防治策略的理想动物模型,成功构建稳定的EAE模型是研究MS的基础。本试验采用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（Myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG）与完全弗氏佐剂（Complete Freund’s adjuvant,CFA）混合乳化后,皮下注射C57BL/6小鼠,并在注射后的0 h和48 h腹腔注射百日咳毒素（Pertussis toxin,PTX）,诱导EAE模型。结果表明:（1）每只小鼠于背部皮下六点注射100μg MOG35-55时,EAE的发病率最高,可达66.7±5.77%;（2）小鼠于注射后第12天开始陆续发病,表现出体重减轻,尾巴和后肢无力,临床评分开始达到1分;随后体重一直下降,病情逐渐加重,后肢逐渐失去行动能力而导致瘫痪,大多数小鼠在第21天左右的临床评分可达到3分;之后症状逐渐缓解,在28天左右会再次复发,体重也随之波动;（3）病理组织切片经HE染色后呈现出明显的小胶质细胞增生聚集现象,脊髓经Luxol Fast Blue染色后可观察到髓鞘脱失现象,表明EAE小鼠构建成功。因此,利用100μg MOG35-55、CFA以及PTX可以高效、稳定地建立小鼠EAE模型。试验二miRNA对iOPCs体外分化成熟的影响为了突破髓鞘形成障碍性疾病治疗中植入干细胞或祖细胞的分化容易卡在OPCs与OLs之间的瓶颈,提高能够生成髓鞘的成熟OLs的获取效率,改善这类疾病的治疗效果,本研究采用间接谱系转化技术重编程NIH/3T3细胞成为iOPCs,并采用不同组合的miRNA（miR23a、miR138和/或miR219）转染iOPCs,通过分析OLs标志蛋白——髓鞘碱性蛋白（Myelin basic protein,MBP）的表达,探讨体外促使iOPCs分化成熟的策略。结果表明:（1）利用Lipofectamine LTX介导Olig2、Nkx6.2和Sox10转录因子的过表达,可以成功地将NIH/3T3细胞重编程为两极突起、A2B5阳性的OPC样细胞,且A2B5阳性率可达到71.24±3.21%;（2）免疫细胞化学染色结果表明各miRNA转染处理组细胞的MBP平均阳性率达到85%以上,且各组之间无显著差异（P>0.05）;RT-qPCR的结果表明转染有miR138的处理组来源iOLs的MBP表达量极显著高于对照组（P<0.01）。在单独转染miR23a或miR219的处理中,iOLs的MBP表达量与对照组没有显著性差异（P>0.05）。同时转染了miR23a、miR138和miR219的处理组中,iOLs的MBP表达量最高。因此iOPCs同时转染miR23a、miR138和miR219有利于促进其分化成为成熟的iOLs。试验三芬戈莫德结合iOPCs移植治疗小鼠EAE的研究鉴于芬戈莫德具有阻止EAE病程进展和改善局部疾病微环境的作用,能为移植iOPCs治疗EAE创造良好的条件,结合转染有miRNA的iOPCs能够分化成为功能性OLs,修复受损髓鞘,达到治疗脱髓鞘疾病的目的,本研究先用FTY720灌胃EAE小鼠,再经侧脑室注射转染有miRNA的iOPCs,通过临床观察、流式细胞术、ELISA检测、磁共振成像（Magnetic resonance imaging,MRI）、Western Blot检测等技术评估EAE小鼠的治疗效果。结果表明:（1）EAE小鼠经FTY720治疗后,临床评分不再升高。流式细胞术结果显示对照组EAE小鼠外周血液中CD4+、CD8+T细胞比例极显著高于正常小鼠（P<0.01）,FTY720治疗组EAE小鼠CD4+、CD8+T细胞比例极显著低于对照组（P<0.01）,且显著低于正常组小鼠（P<0.05）;ELISA结果显示对照组与FTY720治疗组中的IL-17含量分别为384±8ng/L和375±15 ng/L,两者并无显著差异（P>0.05）,但都极显著高于正常小鼠中IL-17的含量（251±5 ng/L）（P<0.01）,说明FTY720通过减少外周血中T淋巴细胞数量对EAE有明显的抑制作用,但对炎症因子IL-17的分泌并无明显抑制效果;（2）在FTY720与iOPCs联合治疗处理组中,EAE小鼠后肢在治疗一周后能在一定程度上恢复抓握能力,MRI检测显示正常小鼠脑部无明显损伤,FTY720治疗组小鼠脑部损伤明显,FTY720与iOPCs联合治疗处理组的损伤情况优于FTY720治疗组,但与正常组相比,仍有较明显的损伤;Western Blot检测也表明FTY720结合iOPCs移植治疗EAE小鼠,其MBP蛋白含量要显著高于FTY720治疗组（P<0.05）,极显著低于正常组（P<0.01）。因此,每只小鼠按0.5 mg/kg·d的量灌胃FTY720一周后,再移植2×105个iOPCs的联合治疗,能够对EAE小鼠损伤的髓鞘产生一定的修复作用。结论:采用100μg MOG35-55多肽结合CFA和PTX可以有效地构建出EAE小鼠模型,注射后第12天开始发病,临床评分最高可达3分;通过过表达转录因子Nkx 6.2、Olig 2和Sox 10获得iOPCs后,转染mi R23a、miR138和miR219可以促使iOPCs向成熟iOLs方向分化;利用FTY720抑制EAE炎症反应后,通过侧脑室注射转染了miRNA的iOPCs,能够在一定程度上修复受损髓鞘,降低EAE评分,这为脱髓鞘疾病的治疗提供了新策略。