三疣梭子蟹作为我国沿海的重要经济水产蟹类,主要产于潮间带海滩广阔的内湾水域。然而,近年来随着集中养殖的不断发展,梭子蟹病害的发生也越来越频繁,包括细菌病、真菌病、寄生虫病等,给我国养殖业带来了巨大的经济损失。其中乳化疾病作为一种细菌性疾病,主要致病菌为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus),是导致三疣梭子蟹高死亡率的一种重要疾病。因此,研究蟹类免疫防御机制和选育抗病、抗逆新品种对蟹的养殖及可持续发展具有重要的潜在意义。传统的选择育种技术价格昂贵、耗时,且容易受到环境的影响,不能满足日益发展的耐药品系的市场需求。近年来,DNA分子标记辅助育种作为一种新的育种方法在全世界兴起,也已成功地用于生产需求,其中单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)因具有其在DNA序列中单碱基突变、遗传稳定、有代表性、位点丰富等优点,使其在遗传研究中得到广泛应用。本研究在实验室已经对的三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶基因进行克隆和表达的基础上,继续对cSP2基因进行蛋白重组表达的研究,验证该基因的功能。同时对PtcSP和PtSPH进行单核苷酸多态性分析,以期通过SNP位点的确定及分析,验证该SNP位点与梭子蟹对溶藻弧菌抗性的关系,进而找到作为梭子蟹抗性选育的分子标记。主要实验结果如下:(1)为了验证三疣梭子蟹PtcSP2的蛋白功能,本实验分别对cSP2基因的两个结构域clip domain和Tryp_SPc domain进行蛋白的重组表达验证其不同的生物学功能。通过蛋白酶活性实验发现PtcSP2中clip domain能够与革兰氏阳性细菌藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌,革兰氏阴性细菌铜绿假单胞菌、溶藻弧菌和毕赤酵母菌结合,说明clip domain具有抗菌活性。通过抑菌试验发现clip domain对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抑菌浓度相同,但是对革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌的抑菌效果相对较小,对酵母菌毕赤酵母无抑菌作用。(2)对60个不同敏感性的梭子蟹个体进行PtcSP基因序列测定,测序成功的梭子蟹中敏感型个体22个,耐受型个体22个。在2355bp的PtcSP DNA片段中共发现了109处SNP位点,其中77处转换,22处颠换,10处插入缺失。在这些位点中,有66处位于内含子中,42处位于编码外显子中,1处位于非编码外显子中。16个编码SNP是同义突变,而26个编码SNP为非同义突变。。非同义突变/同义突变的比率被广泛用来作为一种选择压力的指示,PtcSP基因中,该比率为1.6,表明PtcSP基因在阳性选择下是进化的。其中,三个基因位点,C799,G1480 and CG(1750-1751)的缺失导致开放读码框的提前终止。对PtcSP基因所有的SNP位点不同基因型及等位基因在两个群体中分布频率的统计分析表明,共11个SNP位点与梭子蟹对溶藻弧菌抗性相关。其中SNP位点(I1-(170-175)AACAGT-Ins/del)在基因型和等位基因频率中均存在极显著差异。SNP位点(I1-(186-191)AACAGT-Ins/del)等位基因频率在耐受群体中为45.5%,而在敏感群体中为18.2%,两者之间达到极显著性差异(P=0.006)。其余9个SNP位点都在等位基因频率中表现出显著性差异。在PtcSP DNA片段中共发现了5处SSR位点(表4),都位于为内含子3中,(AGG)n,(AGG)nAA(GAG)m,(AGG)nTA(GAG)m,(AGG)nTG(GAG)m and(AGG)nTGGTG(GAG)m。其中(AGG)10所占比例最高,其次是(AGG)6-9。(AGG)4TGGTG(GAG)5的多态性最少,只在两只抗性蟹子有所发现。(3)对60个不同敏感性的梭子蟹个体进行PtSPH基因序列测定,测序成功的梭子蟹中敏感型个体21个,耐受型个体21个。在1965 bp的PtSPH DNA片段中共发现了77处SNP位点,其中53处转换,18处颠换,6处插入缺失。在这些位点中,有20处位于内含子中,19处位于编码外显子中,38处位于非编码外显子中。19个编码SNPs中,12个SNPs为同义突变,7个为非同义突变。非同义突变和同义突变的比率是0.58,低于中性突变,这可能是因为在PtSPH基因中,这些位点受到功能的制约而处于纯化选择的状态。根据卡方检测结果表明,有3个SNP位点(I1-326,I1-524 and I2-607)有显著差异。对PtSPH基因所有的SNP位点不同基因型及等位基因在两个群体中的分布频率的统计分析表明,共3个SNP位点与梭子蟹对溶藻弧菌抗性相关,且所有的相关性位点均位于内含子中。