目的一直以来广大医家都热衷于用中药大黄治疗CRF,但大黄的炮制品种繁多,且各种炮制品在临床治疗CRF时都有应用,另外生大黄随着煎煮时间的变化其水煎剂的成分含量亦发生改变,而大黄的煎煮时间无明确规定,故本研究旨在利用细胞模型筛选出每种大黄炮制品的煎煮时间,再将筛选出的药物用于动物模型,并从抗氧化应激、抑制TGF-β₁/p38MAPK信号通路、抑制肾小管EMT和抑制炎症反应等方面比较大黄不同炮制品抗肾脏纤维化的疗效,以确定治疗CRF疗效最好的大黄炮制品及和该炮制品相应的煎煮时间,为大黄治疗CRF提供理论依据,并进一步指导临床用药。方法一、第一部分体外实验:1、将145只雄性SD大鼠采用随机数表法分为29组,每组5只,药物组用相应的大黄煎剂（每种大黄炮制品分别煎煮5、7、9、10、15、20、30min）灌胃6日,对照组用0.9%氯化钠液灌胃,水合氯醛腹腔麻醉后腹主动脉无菌取血,制备含药血清。用含药血清干预经TGF-β₁诱导后异常增殖的HRMC 24h及48h,检测细胞增殖率,在每种大黄炮制品中选出细胞增殖率最低的煎煮时间点。2、用TGF-β₁诱导HK-2使其发生EMT,免疫荧光检测TGF-β₁诱导前后HK-2中α-SMA和E-Cadherin的表达,证明细胞纤维化模型成功。用含药血清干预经TGF-β₁诱导的HK-2 24h,ELISA检测各组细胞中α-SMA和E-Cadherin的浓度,在每种大黄炮制品中选出抑制EMT效果最好的煎煮时间点。二、第二部分体内实验:1、在60只雄性SD大鼠采用随机数表法选取10只为对照组,剩下50只用腺嘌呤灌胃4周造成肾衰模型,再次采用随机数表法将造模的50只大鼠分为模型组、生大黄组、熟大黄组、酒大黄组和大黄炭组,每组10只。药物组用体外实验筛选出的药物煎剂进行灌胃（每种炮制品一个）,对照组用0.9%氯化钠液灌胃,治疗8周比较大鼠体重的变化,留取血清和肾组织,用试剂盒检测大鼠的SCr、BUN、UA,比较四种大黄炮制品改善肾脏纤维化大鼠肾功能的作用。2、试剂盒检测大鼠肾组织中T-SOD和MDA的浓度,Wertern Blot检测NOX4的表达,ELISA检测8-OHdG的浓度,比较四种大黄炮制品抗氧化应激的作用。3、Wertern Blot检测大鼠肾组织中TGF-β₁、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白的表达,实时荧光定量PCR检测TGF-β₁ mRNA、p38MAPK mRNA的表达,比较四种大黄炮制品抑制肾脏纤维化大鼠TGF-β₁/p38MAPK信号通路的作用。4、ELISA检测大鼠肾组织中TNF-α和IL-1β的浓度,比较四种大黄炮制品抑制肾脏纤维化大鼠TNF-α和IL-1β表达的作用。5、Western Blot检测大鼠肾组织中α-SMA、E-cadherin的表达,比较四种大黄炮制品抑制肾脏纤维化大鼠EMT的作用。6、通过免疫组化染色检测肾脏纤维化大鼠α-SMA、FN的表达,比较四种大黄炮制品抑制肾脏纤维化标志物生成的作用。7、通过光镜观察大鼠肾组织（PAS染色、Masson染色、HE染色）形态的改变（肾小球、肾小管、肾间质）,电镜观察超微结构的改变,比较四种大黄炮制品治疗CRF的疗效。结果一、第一部分体外实验:1、随着煎煮时间的延长,四种大黄炮制品不同煎煮时间的含药血清培养经TGF-β₁诱导的HRMC 24h和48h的细胞增值率均呈先下降后上升的趋势,24h的细胞增殖率最低分别为71.4%（生大黄组10min）、63.3%（熟大黄组10min）、70.2%（酒大黄组9min）、90.2%（大黄炭组9min）。48h的细胞增殖率最低的分别为78.1%（生大黄组10min）、67.1%（熟大黄组10min）、76.7%（酒大黄组9min）、91.5%（大黄炭组9min）。2、随着煎煮时间的延长,四种大黄炮制品不同煎煮时间的含药血清培养经TGF-β₁诱导的HK-2 24h后α-SMA的浓度均呈先下降后上升的趋势,每种炮制品中α-SMA的浓度最低的分别为52.086ng/ml（生大黄组10min）、44.596ng/ml（熟大黄组10min）、49.768ng/ml（酒大黄组9min）、58.470ng/ml（大黄炭组9min）。而E-cadherin的浓度则呈先上升后下降的趋势,每种炮制品中浓度最高的分别为1.017ng/ml（生大黄组10min）、1.325ng/ml（熟大黄组10min）、1.163ng/ml（酒大黄组9min）、0.787ng/ml（大黄炭组9min）。四种大黄炮制品组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。二、第二部分体内实验:1、模型组大鼠的SCr、BUN、UA都较对照组明显上升（P<0.01）,四种药物组的SCr、BUN、UA都较模型组分别有不同程度的下降（P<0.01）,其中以熟大黄组下降幅度最大,大黄炭组下降幅度最小,酒大黄组下降幅度大于生大黄组。四种药物组之间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。2、模型组大鼠肾组织中NOX4的表达、MDA和8-OHdG的浓度均较对照组明显上升（P<0.01）,四种药物组中以熟大黄组上升幅度最大,大黄炭组上升幅度最小,酒大黄组上升幅度大于生大黄组,组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。模型组大鼠肾组织中T-SOD的浓度较对照组明显下降（P<0.01）,四种药物组中以熟大黄组下降幅度最大,大黄炭组下降幅度最小,酒大黄组下降幅度大于生大黄组,组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。3、模型组大鼠肾组织中TGF-β₁、p38、p-p38蛋白的表达较对照组明显上升（P<0.05）,四种药物组的TGF-β₁的表达与模型组比较均有不同程度的下降（P<0.05）,以熟大黄组下降幅度最为明显,其次是酒大黄组、生大黄组,大黄炭组下降幅度最小。药物组组间比较,各组间TGF-β₁表达的差异均具有显著性（P<0.01）,熟大黄组与其他三种药物组p38和p-p38蛋白表达的差异具有显著性（P<0.01）,酒大黄组与大黄炭组比较差异亦具有显著性（P<0.01）,而其与生大黄组比较无统计学差异。模型组大鼠肾组织中TGF-β₁ mRNA和p38MAPK mRNA的表达较对照组明显上升（P<0.01）,四种药物组的TGF-β₁ mRNA和p38MAPK mRNA的表达与模型组比较均有不同程度的下降（P<0.05）,以熟大黄组下降幅度最为明显,其次是酒大黄组、生大黄组,大黄炭组下降幅度最小。熟大黄组TGF-β₁ mRNA、p38MAPK mRNA的表达与其他三种药物组比较差异均有显著性（P<0.01）,酒大黄组TGF-β₁ mRNA的表达与其他三种药物组比较差异均有显著性（P<0.01）,酒大黄组p38MAPK mRNA的表达与熟大黄组、大黄炭组比较差异均具有显著性（P<0.01）,而与生大黄组比较无统计学意义。4、模型组大鼠肾组织中TNF-α、IL-1β的浓度均较对照组明显上升（P<0.01）,而四种药物组的TNF-α、IL-1β的浓度较模型组有不同程度的下降（P<0.01）。在四种药物组中,下降幅度由多到少的排列顺序为熟大黄组、生大黄组、酒大黄组、大黄炭组,熟大黄组与大黄炭组比较差异具有显著性（P<0.01）,与酒大黄组和生大黄组比较无统计学意义。5、模型组与对照组比较,大鼠肾组织中α-SMA的表达明显升高、E-cadherin的表达明显减少（P<0.01）。四种药物组分别与模型组比较,α-SMA的表达均有不同程度的下调、E-cadherin的表达均有不同程度的上调（P<0.01）。四种药物组抑制EMT的作用效果由强到弱分别为熟大黄组、酒大黄组、生大黄组、大黄炭组,组间比较有统计学意义（P<0.01或P<0.05）。6、与对照组相比,模型组肾组织中满视野可见α-SMA的表达,FN的表达也明显增多,而四种药物组与模型组比较,α-SMA和FN的表达均有不同程度的下降,四种药物组α-SMA和FN的表达由强到弱依次为大黄炭组、生大黄组、酒大黄组和熟大黄组。7、光镜观察肾组织病理切片,模型组的肾小球系膜区基质增多,局部可见玻璃样变,个别肾小球已硬化废弃,肾小囊腔明显增大,大部分肾小管萎缩消失,亦有少部分肾小管代偿性扩张,肾小管上皮细胞空泡状变性,小动脉壁增厚有玻璃样变趋势,肾间质炎细胞浸润增多,纤维组织增生明显。四种药物组与模型组比较,肾小球、肾小管、肾间质的病理改变均有不同程度的改善,其中以熟大黄组的病理改变最为轻微,大黄炭组的病理改变最为严重,酒大黄组和生大黄组的病理改变介于熟大黄组和大黄炭组之间。电镜观察大鼠肾组织微观结构,模型组中可见GBM厚薄不均,局部增厚明显,部分轮廓不清晰,足突弥漫性融合,系膜基质重度增生,系膜区可见电子致密物沉积。四种药物组肾脏病理改变由轻到重依次为熟大黄组、酒大黄组、生大黄组、大黄炭组。结论一、第一部分体外实验:1、四种大黄炮制品均能抑制经TGF-β₁诱导的HRMC的增殖,其中以熟大黄组的整体效果最为理想,大黄炭组的整体效果最差,酒大黄组的整体效果优于生大黄组。筛选出的大黄炮制品抑制经TGF-β₁诱导的HRMC增殖的作用强度由强到弱依次为熟大黄煎煮10min组、酒大黄煎煮9min组、生大黄煎煮10min组、大黄炭煎煮9min组。2、四种大黄炮制品均能抑制经TGF-β₁诱导的HK-2的EMT,其中以熟大黄组的整体效果最为理想,大黄炭组的整体效果最差,酒大黄组的整体效果优于生大黄组。筛选出的大黄炮制品抑制经TGF-β₁诱导的HK-2 EMT的作用强度由强到弱依次为熟大黄煎煮10min组、酒大黄煎煮9min组、生大黄煎煮10min组、大黄炭煎煮9min组。二、第二部分体内实验:1、四种大黄炮制品均能有效改善肾脏纤维化大鼠的肾功能,其作用效果由强到弱分别为熟大黄组、酒大黄组、生大黄组、大黄炭组。2、四种大黄炮制品均有抗OS的作用,其作用效果由强到弱分别为熟大黄组、酒大黄组、生大黄组、大黄炭组。3、四种大黄炮制品均对TGF-β₁/p38MAPK信号通路有抑制作用,其中熟大黄的抑制效果最好,大黄炭的抑制效果最差,酒大黄和生大黄的抑制效果介于熟大黄和大黄炭之间,且它们的抑制效果没有差别。4、四种大黄炮制品均能有效抑制肾脏纤维化大鼠TNF-α和IL-1β的分泌,而生大黄组、熟大黄组、酒大黄组在作用效果上无明显差异,但都强于大黄炭组。5、四种大黄炮制品均能有效抑制肾脏纤维化大鼠肾小管EMT,其作用效果由强到弱分别为熟大黄组、酒大黄组、生大黄组、大黄炭组。6、四种大黄炮制品均能有效抑制α-SMA和FN的表达,其作用效果由强到弱分别为熟大黄组、酒大黄组、生大黄组、大黄炭组。7、四种大黄炮制品均能有效改善肾脏纤维化大鼠的肾组织形态和超微结构,其作用效果由强到弱分别为熟大黄组、酒大黄组、生大黄组、大黄炭组。