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本文对嗜碱芽孢杆菌菌株Bacillus sp.N16-5的甘露聚糖酶的嗜碱分子机制进行了研究。论文取得的主要结果有:
1.通过PCR扩增,获得了编码Bacillus sp.N16-5的甘露聚糖酶的催化域的基因Man5A330,全长960bp,编码320个氨基酸。在大肠杆菌中成功表达并纯化了重组蛋白Man5A330,分子量为36 kD。Man5A330的pH相关活性与从原始菌株外泌蛋白纯化所得的全长酶基本相同,表明该酶的pH相关活性主要是由催化域所决定的,与功能未知的C端序列无关。
2.通过悬滴气相扩散法,在25℃,0.5 M硫酸铵,0.1 M柠檬酸钠(pH5.6),1.2 M硫酸锂,蛋白浓度为2.0mg mL-1时,培养2-3天,成功获得Man5A330的晶体。晶体大小为50×100×200μm,X-ray衍射分辨率达到了1.60(A),空间群为P212121,晶胞参数为a=59.0(A),b=63.3(A),c=83.3(A)。以源自碱性芽孢杆菌JAMB602中的碱性甘露聚糖酶的晶体结构参数(1wky)为模型,通过分子置换的方法解析得到了Man5A330的结构。结构晶体学R因子和自由R因子分别为0.174和0.215。结构模型中包括有295个氨基酸残基。结构坐标提交至PROTEIN DATA BANK,PDB号为3jug。
3.通过与pH相关性质已知的所有的糖苷水解酶家族5中的甘露聚糖酶进行比较,我们发现了一系列甘露聚糖酶嗜碱的分子特征。
1)对所有已知的甘露聚糖酶进行系统发育分析,得到了两个分支:分支A主要来自真核生物,归入GH5-7或者是GH5-10;另一个分支B(包括目的酶)来自原核生物,归入GH5-8。统计表明,分支B的甘露聚糖酶最适pH显著高于分支A。比较两个分支的氨基酸组成发现,分支B的甘露聚糖酶中的疏水氨基酸及其精氨酸的含量增加而极性氨基酸的含量降低。由此推测提高疏水氨基酸及其精氨酸的含量而降低极性氨基酸的含量可能有助于甘露聚糖酶在较高pH条件下发挥催化活性。
2)通过二级结构比较发现,碱性的甘露聚糖酶通过调整β折叠、α螺旋和无规则卷曲的位置和长度,改变催化位点的微环境,使其能够在高碱环境下发挥活性。
3)通过分析表面氨基酸发现,为了适应碱性环境,碱性甘露聚糖酶提高了分子表面带负电荷的氨基酸含量,同时降低极性氨基酸的含量。
4)通过结构比较、序列比对、pKa计算和突变实验验证,表明位点Gln91和Glu226(依照Man5A330命名)对于碱性甘露聚糖酶在高碱条件下发挥活性起到重要调控作用的。
4.采用易错PCR的方法构建随机突变体文库,通过转化子的活性筛选,共筛选得到了6个最适pH向酸性偏移的突变体:Trp92Arg、Trp163Ala、Tyr227Ala、Ser288Gly、Trp2961Val和Glu226Gln。它们通过疏水作用、空间位阻或是电荷的改变影响到源自芽孢杆菌N16-5的碱性甘露聚糖酶的嗜碱特征及其活性。
5.采用单点突变的方法,探究精氨酸替代赖氨酸对于源自碱性芽孢菌N16-5的甘露聚糖酶嗜碱特性的影响。实验结果表明,这一替代并没有提高BSP165 MAN的最适pH。