背景调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)是一类具有显著免疫调节功能的CD4+T细胞亚群,通过抑制树突状细胞(DC)、T细胞等免疫细胞的功能活性在脓毒症免疫紊乱中发挥关键调节作用。内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是在多种生理或病理条件下引起内质网(ER)腔内未折叠蛋白或错误折叠蛋白聚集,导致ER功能受损的状态。研究发现脓毒症可诱发机体发生ERS反应,通过调控多种免疫细胞功能,在免疫炎症反应中发挥重要作用。尽管目前已经明确Treg在脓毒症免疫紊乱中发挥关键作用,ERS是否影响Treg细胞的功能及机制,目前尚未见研究报道。目的采用ERS特异性诱导剂毒胡萝卜素(thapsigargin,TG)刺激正常及内毒素(LPS)体外模拟脓毒症刺激条件下的小鼠脾脏Treg细胞,旨在探讨ERS对Treg细胞功能的影响及其机制。方法1、免疫磁珠法分离正常BALB/C小鼠脾脏Treg细胞及CD4+T细胞,流式细胞术鉴定Treg细胞纯度。依TG(0.1μmol/L)刺激的时间不同分为0、6、12、24h组,依TG刺激的浓度不同设为0、0.05、0.1、0.2μmol/L组,刺激12h后,流式细胞术检测Treg Foxp3及CTLA-4表达的时间/剂量效应关系,确定最佳实验浓度及时间。2、给予TG刺激后,分别采用共聚焦显微镜检测内质网形态、蛋白印迹分析(Western blot)检测PERK信号通路GRP78、PERK、eIF2α、ATF4的表达变化,评价TG诱导Treg ERS的状态,分别采用流式细胞术、酶联免疫吸附试验(ELISA)、CFSE示踪染料标记法检测Treg的Foxp3及CTLA-4表达、细胞因子分泌、Th1/Th2分化及对Teff的增殖抑制反应,评价Treg的功能状态,并结合PERK信号通路抑制剂(GSK2656157),分析阻断PERK信号通路后,Treg的功能变化,探讨ERS调节Treg功能的分子机制。3、给予LPS模拟体外脓毒症刺激,应用TG后,应用上述实验方法检测Treg细胞内GRP78、PERK、eIF2α、ATF4的表达、Foxp3 CTLA-4的表达、细胞因子分泌、Th1/Th2分化及对Teff的增殖抑制反应以及应用GSK2656157对Treg功能活性的影响,分析体外脓毒症状态下,ERS对Treg功能状态的影响和可能作用靶点。结果1、采用免疫磁珠分选得到Treg和Teff的纯度分别为91%、88.2%,符合后续实验要求;检测Foxp3及CTLA-4的表达的时效量效关系,结果表明,TG0.1μmol/L作用12h,Foxp3的表达变化最为显著,故选择TG0.1μmol/L、12h用于后续实验。同时,本研究显示上述作用浓度及时间,Treg CTLA-4的表达均无明显变化。2、给予TG刺激后,激光共聚焦显微镜检测Treg内质网形态发生改变,内质网碎裂、膨胀、并偏向核一侧聚集;GRP78、PERK、ATF4及eIF2α的磷酸化水平显著上调,同时Treg Foxp3表达,IL-10和TGF-β的分泌均明显增加,与Treg共培养的Teff增殖活性受到明显抑制,培养上清中IL-4/IFN-γ比值明显升高,IL-2生成下降(P<0.05),而给予阻断剂GSK2656157后Treg Foxp3表达,IL-10和TGF-β的分泌均明显降低,与Treg共培养的Teff增殖活性抑制情况减弱,共培养上清中IL-4/IFN-γ比值降低,IL-2生成增加(P<0.05)。3、LPS刺激Treg模拟体外脓毒症状态下,给予TG刺激后,GRP78、PERK、ATF4及eIF2α的磷酸化水平显著上调,同时Treg Foxp3表达,IL-10和TGF-β的分泌均明显增加(P<0.05),与Treg共培养的Teff增殖活性受到明显抑制,培养上清中IL-4/IFN-γ比值明显升高,IL-2生成下降(P<0.05),提示TG在LPS协同作用下进一步增强Treg免疫抑制活性;而给予阻断剂GSK2656157后检测到GRP78、PERK、ATF4及eIF2α的磷酸化水平显著下降,Treg Foxp3表达,IL-10和TGF-β的分泌均明显降低(P<0.05),与Treg共培养,Teff的增殖活性抑制情况减弱,培养上清中IL-4/IFN-γ比值降低,IL-2生成增加(P<0.05)。结论ERS是细胞应对内外环境刺激下的一种保护性机制,研究表明ERS对免疫细胞的功能状态具有重要调节效应。本研究结果显示:1、给予ERS诱导剂TG刺激后,内质网形态发生改变,内质网碎裂、膨胀、并偏向核一侧聚集;GRP78、PERK、ATF4及eIF2α的磷酸化水平显著上调,提示TG诱导ERS反应发生,Treg Foxp3表达,IL-10和TGF-β的分泌均明显增加,Teff的增殖活性受到明显抑制,培养上清中IL-4/IFN-γ比值明显升高,IL-2生成下降,提示TG诱导的ERS可明显增强Treg的功能活性,而应用PERK抑制剂后,Treg的功能活性显著降低,提示PERK信号途径是影响Treg功能的可能作用靶点。2、LPS刺激Treg模拟体外脓毒症条件下,给予TG刺激,活化PERK信号通路诱导ERS反应的同时,进一步增强Treg的功能活性,而给予PERK抑制剂后,通过阻断PERK信号通路上分子的表达,下调Treg功能。提示ERS可能通过PERK信号通路调节Treg的免疫活性参与脓毒症免疫紊乱的发生发展,而阻断Treg PERK信号通路可能为脓毒症免疫紊乱的治疗提供潜在作用靶点。