骨髓增生异常综合征（Myelodysplastic syndromes,MDS）是由全能干细胞恶性变化导致分化障碍的一组克隆性、异质性的造血干细胞病,具有极高风险进展为急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia,AML）。AML是起源于造血干/祖细胞,以骨髓和外周血中髓系前体细胞异常增生为特征的一种恶性血液肿瘤。近年来MDS与AML的发病率不断升高,严重威胁着人类的生命健康。随着人们对表观遗传学研究的深入,越来越多的研究发现DNA甲基化异常（通常是高甲基化状态）在MDS/AML的发生发展中起到重要作用。因此,去甲基化药物（如地西他滨、阿扎胞苷等）被广泛应用于MDS各个亚型的治疗中,但是仍有部分患者在接受去甲基化治疗后产生明显的耐药,导致病情无明显缓解或者复发。因此,理解MDS病人对去甲基化药物的耐药机制至关重要。TWIST1是一种具有碱性螺旋-环-螺旋结构的转录因子,可识别并结合E-box序列,从而调控靶基因的表达。前期研究表明MDS病人中TWIST1的表达异常升高,具有潜在的促癌作用。在前期实验中,本实验室发现在脐带血来源的造血干细胞（以下简称CD34+细胞）中过表达TWIST1后,细胞基因组整体甲基化水平显著升高,基因转录受到明显抑制。因此推测在MDS/AML中TWIST1的表达与DNA甲基化密切相关。结合临床样本发现,地西他滨耐受的MDS/AML病人的单个核细胞中TWIST1的表达显著高于地西他滨敏感的MDS/AML病人,提示TWIST1可能参与调控MDS/AML病人的地西他滨耐药性。由此,本文通过细胞和小鼠模型,结合临床样本,系统地阐明TWIST1参与调控髓系恶性克隆细胞中DNA甲基化及对地西他滨产生耐受的分子机制。主要结论如下:1、TWIST1的表达与地西他滨耐药的相关性分析:对临床样本分析结果显示,与地西他滨敏感的MDS/AML病人的单个核细胞相比,地西他滨耐受的MDS/AML病人的单个核细胞中TWIST1和甲基化转移酶3a（DNMT3a）的表达,以及基因组整体甲基化水平均显著升高;CD34+细胞中过表达TWIST1,基因组甲基化水平升高,基因组整体转录受到抑制;相反地,在CD34+细胞中敲减TWIST1后,基因组甲基化水平降低,基因组转录激活;同时在地西他滨耐药的AML细胞株（KG1a-DAC-R）中发现TWIST1表达上调;在髓系恶性克隆细胞KG1a中过表达TWIST1后（KG1a-TWIST1）,可以促进KG1a细胞在地西他滨处理条件下的增殖,相反在髓系恶性克隆细胞SKM1及OCI-AML3中敲减TWIST1后,则抑制细胞在地西他滨处理条件下的增殖;在人源细胞嵌合的小鼠模型中,将KG1a和KG1a-TWIST1通过尾静脉注射进辐照后的小鼠体内,经地西他滨处理6次后,小鼠外周血、脾脏及骨髓中KG1a-TWIST1的含量显著高于KG1a细胞。2、TWIST1与甲基化转移酶DNMT3a相互作用及结合位点的鉴定:串联亲和质谱分析结果显示,TWIST1可以与多个参与基因组甲基化及染色质修饰的蛋白相互作用,其中包括DNMT3a;经免疫共沉淀检测发现,在KG1a-TWIST1、SKM1及OCI-AML3细胞中均可检测到TWIST1与DNMT3a的结合,细胞免疫染色也显示TWIST1与DNMT3a在细胞核内存在共定位;蛋白互作表位实验鉴定到TWIST1蛋白有四个连续多肽片段（19-23,53-57,60-64,66-70号多肽）可与DNMT3a结合,通过免疫酶联反应及免疫共沉淀筛选出66-70号多肽（序列为LRKIIPTLPSDKLSKIQTLKLAA）可有效抑制TWIST1与DNMT3a的结合;使用66-70号多肽处理细胞可有效增强KG1a-TWIST1对地西他滨的敏感性;在人源细胞嵌合的小鼠模型中,将KG1a-TWIST1细胞通过尾静脉注射入辐照后的小鼠体内,分别注射地西他滨或地西他滨与66-70号多肽6次后,流式细胞术分析小鼠外周血中KG1a-TWIST1的含量。结果显示,与仅注射地西他滨相比,共同注射66-70号多肽与地西他滨后,小鼠外周血内KG1a-TWIST1细胞的含量显著降低,说明66-70号多肽可以通过抑制TWIST1与DNMT3a的结合增强髓系恶性克隆细胞对地西他滨的敏感性。3、TWIST1/DNMT3a复合体调控下游目的基因甲基化的研究:基因组甲基化芯片结果显示,在TWIST1过表达的KG1a细胞中,启动子区含有E-box序列的基因甲基化水平发生显著变化,其中细胞周期依赖激酶抑制基因CDKN1A和CDKN1C甲基化水平显著升高,特异性甲基化PCR结果与芯片结果一致;在地西他滨处理后的KG1a-TWIST1细胞中,细胞周期相关基因CDKN1A和CDKN1C启动子区甲基化水平降低,m RNA表达水平升高,但是变化的趋势显著低于KG1a细胞;细胞周期检测结果显示,地西他滨处理后KG1a细胞发生G0/G1期阻滞,而在KG1a-TWIST1细胞中,地西他滨处理造成的G0/G1期阻滞显著降低;在CD34+细胞中过表达TWIST1后,增强了CDKN1A和CDKN1C启动子区的甲基化,抑制了CDKN1A和CDKN1C的转录,最终促进了CD34+细胞在地西他滨处理情况下的增殖;对临床样本分析结果显示,与地西他滨敏感的MDS/AML病人相比,地西他滨耐受的MDS/AML病人单个核细胞中CDKN1A和CDKN1C启动子区甲基化水平升高,表达水平降低。4、O-GlcNAc糖基化对TWIST1功能的影响:对临床样本分析结果显示,与地西他滨敏感的MDS/AML病人相比,地西他滨耐受的MDS/AML病人的单个核细胞中OGT表达显著升高;流式细胞术检测细胞增殖结果显示,OGT抑制剂OSMI-1处理KG1a-TWIST1后,可显著增强细胞对地西他滨的敏感性;免疫共沉淀富集TWIST1,蛋白印迹检测TWIST1蛋白上存在O-GlcNAc糖基化修饰;使用OSMI-1处理细胞发现,OSMI-1可以抑制TWIST1与DNMT3a的结合,并且TWIST1的表达随着OSMI-1处理浓度增加而减少,随着处理时间的增长而减少;检测OSMI-1处理后TWIST1的稳定性,发现OSMI-1处理后TWIST1蛋白泛素化修饰增多,并通过蛋白酶体途径被降解,说明O-GlcNAc糖基化可以增强TWIST1的稳定性;通过染色质共沉淀和双荧光素酶报告基因实验发现TWIST1可结合于OGT启动子区并激活OGT的转录。