论文部分内容阅读
Flavopiridol是一种黄酮，最初来源于一种叫做红果樫木的印度植物，现在已经可以人工合成。它是一种细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶（CDKs）抑制剂，可以抑制所有CDKs的活性，其中对cdk-1,2,4的抑制最明显。正因如此它可以使细胞复制停留在G2/M期。最近越来越多的实验已经证实flavopiridol可以使多种细胞发生周期阻滞。所以我们推测flavopiridol对Eca109（一种食管鳞癌细胞系）也有细胞周期阻滞的作用，从而增加Eca109的放射敏感性。通过前期实验已测定flavopiridol对Eca109细胞系的IC50（半数致死量）为193.3nmol/L，并证明对ECa-9706细胞株具有放射増敏作用，0.2×IC50即38.66nmol/L flavopiridol的SER（放射増敏比）为1.194。但其对食管癌Eca109细胞株放射増敏的分子机制还不甚清楚。研究发现CyclinD1蛋白在人多种肿瘤细胞中均有表达异常，本实验通过flavopiridol联合放射线共同作用于Eca109细胞系，通过实验前后食管癌Eca109细胞周期的变化情况以及ERK/pERK，CyclinD1蛋白表达水平的变化情况，分析flavopiridol对食管癌Eca109细胞的放射増敏作用机制，为flavopiridol应用于临床食管癌放射増敏治疗提供实验依据。目的：研究flavopiridol（一种细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制剂）对食管鳞癌细胞系Eca109的放射增敏作用及其机制。方法：应用MTT法分析单独应用flavopiridol对Eca109的生长抑制作用，并计算其IC50。克隆形成实验用来确定flavopiridol的放射增敏性并计算其放射增敏率。通过流式细胞计数分析不同处理组细胞凋亡率及周期分布的变化，从而初步探究增敏的机制。应用免疫印迹实验分析不同处理组caspase-3，Bcl-2，Bax，cyclinD1和ERK/pERK蛋白的含量进一步研究其放射增敏的机制。结果：1.MTT分析显示单独应用flavopiridol可以降低细胞生存率，作用大小受浓度梯度的影响，IC50为193.3nmol/L。2.通过克隆形成实验得知细胞克隆数量随放射剂量的增加而减少，但是在FR组中克隆数减少的更加明显。这说明flavopiridol对Eca109有放射增敏作用。按多靶单击模型(SF=1-(1-e-D/D0)N)拟合生存曲线得到放射增敏比SER=1.194(药物浓度为0.2×IC50)。3.流式细胞技术法用来测定不同处理组细胞周期的分布以及凋亡率。细胞周期分布的情况为，G2/M期细胞在FR组和F组中（分别为29.18±9.26%和18.23±7.47%）明显高于C组和R组（分别为3.46±2.47%和5.81±2.50%），差异有统计学意义（P<0.05）。数据表明低剂量的flavopiridol可以增加G2/M期的细胞数量。细胞凋亡率的情况为，FR组的凋亡率（37.92±16.15%）明显高于其他三组（C组：15.53±5.40%；F组：15.50±7.95%；R组：22.76±9.71%），差异有统计学意义（P<0.05）。结果表明flavopiridol可以增加因放射线引起的细胞凋亡。4.免疫印迹实验用来测定相关蛋白的含量。在FR组中Caspase-3和Bax的含量明显增高，Bcl-2的含量明显降低，所以我们推测FR组中的细胞凋亡主要是由凋亡蛋白增加引起的。在FR组中cyclinD1的含量明显低于其他三组，而ERK/pERK的含量在四组中的差别没有统计学意义（P<0.05）。这意味着flavopiridol可能通过直接降低cyclinD1的含量增加G2/M期的细胞。结论：1.Flavopiridol可以增加Eca109的放射敏感性，即可以增加因放射线引起的凋亡蛋白caspase-3，Bax的含量，降低凋亡抑制蛋白Bcl-2的含量，从而提高细胞凋亡率。2.Flavopiridol通过降低cyclinD1的含量增加G2/M期的细胞比例，从而提高Eca109的放射敏感性。