背景与目的慢性髓细胞白血病（CML）是一种起源于造血干细胞的增殖性肿瘤,以具有9号和22号染色体易位所产生的Ph染色体为特征,这种染色体所形成的Bcr-Abl融合基因所编码的蛋白具有异常的酪氨酸激酶活性,进而导致CML发病。甲磺酸伊马替尼（IM）是一种Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂目前已成为临床治疗CML的一线用药。伊马替尼的应用尽管能使大部分慢性期CML患者5年生存期明显改善,但仍有一部分患者病情会反复或进展。因此,目前临床上IM耐药已成为治疗过程中最主要的难题。既往对IM耐药的研究机制主要限于对白血病本身的研究,其中最常见的原因是Abl激酶结构域发生的点突变抑制了激酶与IM效应位点的结合。其他的耐药机制主要包括Bcr-Abl基因的序列扩增、Bcr-Abl蛋白产物的过度表达、胞内药物浓度的下降等。随着近年研究,人们发现由于HSC的直接缺陷,或者骨髓内来源的调控信号异常,会造成HSC和niche之间的crosstalk发生改变,这种变化使原本正常的骨髓微环境的失衡,转而成为残留的白血病干细胞（LSC）保护性的异常微环境,我们称其为骨髓微环境介导的耐药,这是白血病残留、复发的主要原因之一,也成为近年来的研究热点。骨髓造血微环境,又称niche,是指适宜骨髓HSC生存的特定微环境,主要包括骨髓基质细胞、细胞外基质（ECM）和多种造血生长因子,三者共同组成了一个高度复杂而有效的调节网络对支持和调节造血干细胞的增殖、分化和成熟发挥重要作用。成骨细胞是骨髓微环境中的重要的基质细胞,它不但维持着HSC的静息状态,同时也对支持和维持造血干细胞的分化和功能。有研究发现,成骨细胞与骨髓HSCs共同移植到异基因小鼠能增加HSCs存活率;而成骨细胞剔除的小鼠其造血功能丧失。在骨髓中成骨细胞来源于间充质干细胞（MSC）。MSC是一种具有多种分化潜能的基质细胞,在骨髓内主要驻留在血管周围[63-64],是成骨祖细胞的主要来源[65]对维护骨组织稳态起到关键性的作用。MSCs在甲状旁腺激素等相关因子的调节下向成骨细胞分化[66-68],并分泌骨桥蛋白,骨钙素等功能性蛋白。迄今为止,我们对MSC如何离开血管周niche迁移至骨表面而最终形成骨的具体机制尚不清楚。Eph是最大的酪氨酸激酶受体蛋白家族。它在调控细胞运动、定位、分选、迁移以及边界的形成的过程中具有重要作用。通过细胞与细胞的接触使膜表面的受体和配体结合,激活受体的前向通路和（或）配体的反向通路从而发挥生物学功能。近年来文献表明,Eph/ephrin多种分子蛋白在骨髓微环境中参与调控造血细胞的迁移,骨稳态的形成。Xing等[71]认为ephrinB1反向通路是骨形成的重要通路,通过实验发现ephrinB1通过激活PDZ功能区介导成骨分化,应用TAZ结合性基序使PDZ去磷酸化会导致核转位,随后激活特异性的成骨转录因子（Osterix）。目前,大量文献研究主要涉及的是Eph/ephrin分子对正常MSC细胞生物学行为的影响。本次研究目的在于研究Eph/ephrin分子在对慢性髓系白血病MSC生物学行为的影响,从而进一步探究其在CML耐药中的作用。本课题组前期实验证实了在慢性髓系白血病难治/复发、急变慢粒的患者细胞株及K562均有EphB4高表达,因此,我们推测白血病细胞通过EphB4膜受体,对骨髓niche中MSC的生物学特性产生影响,从而为整个骨髓微环境的改变打下基础。本课题拟从EphB/ephrinB通路对MSC成骨分化、细胞伸展及迁移等特性的影响为切入点,拟探索EphB在这一现象中的作用及其机制。研究方法1.MSC细胞的分离及培养以密度梯度离心的方法[56]分离人骨髓MSC,用含10%胎牛血清的间充质干细胞完全培养基重悬细胞,接种于培养瓶内,于5%CO2 37℃,恒温培养箱中培养。2.MSC细胞的成骨诱导分化将MSCs细胞用胰酶消化后,以培养基重悬细胞,接种到6孔板中,达到70%-80%融合后,改为成骨诱导培养基,置于5%CO2 37℃恒温培养箱中培养,每2-3天换液,14天后茜素红染色评估钙结节的情况。3、半定量PCR分析用Trizo1方法提取细胞RNA,逆转录为cDNA,扩增、分析。具体方法如全文。4.Western Blot 分析RIPA裂解液提取蛋白,BCA法测定蛋白浓度。采用SDS-PAGE电泳法分离目的蛋白、转印蛋白至PVDF膜。凝胶成像系统扫描,读取各电泳条带。5、Transwell迁移实验将多聚化的EphB-Fc、ephrinB-Fc蛋白加入到Transwell迁移小室的下层小室。以3×104细胞/孔种于Transwell迁移小室的上层小室中,于5%CO2 37℃孵箱中孵育24h。固定,观察外侧细胞,用DAPI染色,计数,实验重复三遍。6.细胞伸展实验将多聚化的EphB-Fc、ephrinB-Fc蛋白工作液加入孔板中,于37℃ 5%CO2孵箱中孵育2h,PBS清洗。以8×103细胞/孔种于细胞板中,于5%CO237℃孵箱中孵育3h。对于抑制实验,细胞先与通路抑制剂室温孵育30min,之后再加入到孔板中,固定,用染色后,于共聚焦显微镜下观察,拍照。7、移植物模型NOG鼠（4-5周龄）分别建立急性髓系白血病模型和皮下移植瘤模型。设计分组 K562-R、K562-R+MSC、K562-R-EphB4-sh、K562-R-EphB4-sh+MSC、MSC和1个空白对照组,于NOG鼠骨髓腔内注射,建立急性白血病模型。同时按上述分组建立皮下移植瘤模型。检测体重,外周血流式检测及皮下结节。待小鼠确认成瘤后,给予Imatinib处理。8.统计学分析数据采用SPSS 20.0软件处理。所有实验重复3次,计量资料用均数土标准差描述。对比2组差异用独立样本t检验,对3组及以上实验组组间比较采用单因素方差分析。在动物实验中,IM未处理及处理组的指标对比,采用配对t检验。P<0.05时,差异具有统计学意义。结果1、CML-CP（CCP）来源的MSCs细胞形态、增殖能力及成骨、成脂分化能力与CML-BC（CBC）来源的MSCs和正常的MSCs有显著差别。2、CCP骨髓来源MSCs细胞ALP、RUNX2mRNA和OCN蛋白质表达较正常人和CBC来源MSCs显著升高。3、CCP 骨髓来源 MSCs 细胞 EphB4 ephrinB2 EphB2 ephrinB1mRNA 为高表达,其蛋白表达水平较正常人和CBC来源MSCs增高。4、EphB4-Fc通过ephrinB 1和或ephrinB2反向通路激活STAT3蛋白促进的CCP来源的MSCs细胞成骨分化。5、EphB4-Fc通过ephrinB2反向通路激活PI3K及JNK蛋白,而不是Src蛋白,介导MSCs细胞的伸展。6、ephrinB2-Fc通过EphB4正向通路激活Src及Abl蛋白,而不是PI3K蛋白介导MSCs细胞的迁移。7、EphB4高表达的K562-R在成骨分化条件下通过直接接触的方式促进CCP-MSCs ALP\RUNX2 mRNA表达。8、EphB4-Fc引起的CCP-MSC异常成骨分化促进K562细胞对IM耐药,改变K562细胞周期,降低K562细胞凋亡率。9、以NOD/SCID/yc-/-（NOG）鼠分别通过骨髓腔注射和皮下注射的方式建立急性白血病模型及皮下移植瘤技术成熟、稳定可靠。10、骨髓腔和皮下移植瘤的蛋白表达存在差异。11、骨髓腔小鼠RUNX2和VEGF基因表达均较皮下移植瘤显著增高,组间Runx2表达有显著差异,与MSC及EphB4表达高低密切相关,Runx2高表达对IM显著耐药。12、皮下移植瘤中,VEGF表达与MSC及EphB4表达高低密切相关,高VEGF表达对IM显著耐药。结论1、CML-CP来源的MSCs存在成骨分化功能异常。2、这种异常的成骨分化是白血病细胞与MSC通过EphB4/ephrinB的信号异常激活而引起的。3、异常的成骨分化可进一步促进白血病细胞耐药。