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目的本研究通过建立D-丝氨酸(D-Ser)干预的铅暴露大鼠模型,观察大鼠海马组织中N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体表达、Ca2+浓度以及氨基酸类神经递质含量等方面的变化,初步阐明D-Ser对大鼠学习记忆功能的影响机制。方法1实验动物及分组:21天健康雄性SPF级SD大鼠60只,体重140-160g,适应性喂养一周后随机分为4组,分别为空白对照组(500mg/kg醋酸钠)、铅暴露组(500mg/kg醋酸铅+隔日生理盐水注射)、D-Ser低剂量组(500mg/kg醋酸铅+隔日30mg/kg D-Ser腹腔注射)、D-Ser高剂量组(500mg/kg醋酸铅+隔日60mg/kg D-Ser腹腔注射)。采用自由饮水方式连续染毒8周。2应用Morris水迷宫进行神经行为学测试。3应用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)分析大鼠组织中铅元素含量。4应用流式细胞术分析大鼠海马神经细胞凋亡率、海马细胞Ca2+浓度以及活性氧(ROS)含量。5应用HE染色法观察大鼠海马组织病理改变;6应用尼氏染色法观察大鼠海马神经元细胞及结构的变化。7应用透射电镜观察海马神经元细胞结构及形态的变化。8免疫组化方法观察大鼠海马组织中NR2A蛋白、NR2B蛋白表达的变化。9应用实时荧光定量PCR方法测定海马组织中NR2A蛋白、NR2B蛋白及丝氨酸消旋酶(Srr)m RNA表达变化。10高效液相色谱法测定海马组织中4种氨基酸类神经递质(谷氨酸Glu、丝氨酸Ser、甘氨酸Gly、γ-氨基丁酸GABA)含量的变化。11统计学分析实验数据均采用均数±标准差(sx±)表示,各组间比较采用单因素方差分析(One Way ANOVA),两两比较采用LSD检验,以P<0.05为差异具有统计学意义。结果1实验大鼠的一般情况:在染毒期间,所有实验大鼠摄食和饮水量未见异常。饲养过程中,实验大鼠体重正常增长,各组体重增加变化无差异。2 D-Ser干预对铅暴露大鼠学习记忆能力的影响:Morris水迷宫实验结果显示,与对照组比较,铅暴露组大鼠的逃逸潜伏期增长(P<0.05),穿台次数下降(P<0.05);与铅暴露组比较,D-Ser低剂量组与D-Ser高剂量组大鼠的逃逸潜伏期降低(P<0.05),穿台次数增加(P<0.05)。3 D-Ser干预对铅暴露大鼠血液、海马和皮质中铅含量变化的影响:与对照组比较,铅暴露组大鼠海马组织铅含量是对照组大鼠海马组织铅含量的3.49倍;D-Ser低剂量组及D-Ser高剂量组大鼠海马组织中铅含量变化与铅暴露组比较无差异(P>0.05)。同样,D-Ser低剂量组与D-Ser高剂量大鼠皮质、血液中铅含量变化趋势与海马中铅含量变化趋势相同。4 D-Ser干预对铅暴露大鼠海马组织细胞凋亡的影响:铅暴露组大鼠海马神经细胞早期凋亡率、晚期凋亡率分别为25.40±4.44%、16.30±4.39%,高于对照组的16.70±5.79%、12.43±3.40%(P<0.05)。D-Ser低剂量组大鼠海马细胞早期凋亡率和晚期凋亡率分别为19.03±5.01%、11.02±2.55%,D-Ser高剂量组大鼠海马细胞早期凋亡率和晚期凋亡率分别为18.93±3.83%、12.93±2.28%,与铅暴露组比较显著下降(P<0.05)。5 D-Ser干预对铅暴露大鼠海马组织ROS含量的影响:铅暴露组ROS含量显著高于对照组(P<0.05);D-Ser低剂量组、D-Ser高剂量组ROS含量与铅暴露组比较无统计学差异。6 D-Ser干预对铅暴露大鼠海马细胞Ca2+浓度的影响:与对照组比较,铅暴露组大鼠海马细胞Ca2+浓度增加,是对照组的1.94倍(P<0.05);D-Ser低剂量组、D-Ser高剂量组大鼠海马细胞Ca2+浓度低于铅暴露组,有显著差异。7 D-Ser干预对铅暴露大鼠海马组织病理结构的影响:光镜下观察可见,对照组大鼠海马细胞完整,排列紧密规则;铅暴露组大鼠海马细胞排列紊乱,大量细胞死亡,表现为细胞核固缩、破裂。D-Ser低剂量组及D-Ser高剂量组大鼠海马细胞排列稍有紊乱,但细胞形态基本正常。尼氏染色显示对照组大鼠海马神经元细胞排列紧密、整齐,细胞结构完整,细胞核核仁清晰。铅暴露组大鼠神经元细胞排列疏松、紊乱,部分细胞结构不完整。D-Ser低剂量组及D-Ser高剂量组大鼠神经元细胞排列稍有紊乱,少量细胞结构不完整。透射电镜结果显示,对照组海马神经元细胞的细胞核饱满,核膜光滑,染色质分布均匀,髓鞘厚度和数量均正常。铅暴露组海马神经元细胞的胞核皱缩、大量染色质边集;D-Ser低剂量组和D-Ser高剂量组海马神经元细胞有轻微的核皱缩和染色质边集现象。铅暴露组、D-Ser低剂量组和D-Ser高剂量组海马神经元细胞均有不同程度的细胞器数量减少、线粒体肿胀、髓鞘厚度变薄等现象。8 D-Ser干预对铅暴露大鼠海马组织中NR2A和NR2B表达的影响:免疫组化结果显示,铅暴露组大鼠海马组织中NR2A蛋白表达低于对照组(P<0.05);与铅暴露组比较,D-Ser高剂量组大鼠海马组织中NR2A蛋白表达升高(P<0.05)。铅暴露大鼠海马组织中NR2B蛋白表达变化与对照组比较无统计学意义。海马组织中NR2A、NR2B及Srr m RNA表达的变化:与对照组比较,铅暴露组大鼠海马组织中NR2A和Srr m RNA表达下降(P<0.05)。D-Ser高剂量组大鼠海马组织中NR2A和Srr m RNA表达高于铅暴露组(P<0.05)。未见大鼠海马组织中NR2B m RNA表达发生显著性改变。9海马组织中氨基酸类神经递质含量的变化:与对照组比较,铅暴露组大鼠海马组织中Glu含量显著升高(P<0.05),为对照组Glu含量的1.26倍;与铅暴露组比较,D-Ser低剂量组和D-Ser高剂量组大鼠海马组织中Glu含量变化无差异。各组大鼠海马组织中Ser、Gly和GABA含量比较无显著差异。结论D-Ser通过降低海马细胞凋亡率,降低海马细胞中Ca2+浓度,并使NR2A蛋白和m RNA表达升高,从而对海马神经功能损伤起到一定的保护作用,缓解了铅暴露所致的大鼠学习记忆能力损伤。