第一部分小鼠原位左肺移植模型的建立(中国国内首创)目的探讨如何建立稳定的小鼠原位左肺移植模型。方法雄性FVB小鼠随机分成供体和受体,采用自创的三套管法建立小鼠原位左肺移植模型。结果手术成功率在90%以上,冷缺血时间35.6±5.9mmin,热缺血时间25.3±7.2min,供肺准备时间21±5.6min,整个手术时间85±15min,术后受体存活时间达到30d以上,术后一月显微CT显示左肺野清晰,左支气管通畅,阻断小鼠右侧肺门前后,检测动脉血气,结果无显著性差异。术后一月病理学检查显示肺移植物结构基本正常,与正常右侧肺相似,肺泡通气功能良好。结论我们在大鼠原位左肺移植模型的基础上,自行摸索,独立地建立了成功的小鼠肺移植模型,与国外建立的该模型相比,我们的方法具有操作简便易行,模型稳定的特点,这在国内属于首创,为肺移植的基础研究打下了坚实的基础。第二部分应用生物发光技术活体监测小鼠肺移植排斥反应并评价环孢霉素的治疗效果目的探讨应用生物发光技术在体监测小鼠肺移植排斥反应以及评价抗排斥反应药物环孢霉素治疗效果的可能性。背景在体监测器官移植排斥反应具有很大的临床应用前景。当前,诊断排斥反应的金指标是活组织检验,该方法不仅具有侵袭性,而且还可能造成样本误差。本研究的目的是为了探索采用生物发光显像技术活体监测肺移植排斥反应的可能性,并进一步使用该方法评价不同剂量抗排斥反应药物环孢霉素的治疗效果。方法及结果采用表达生物荧光素酶-绿色荧光蛋白(Luc-eGFP)的转基因L2G85小鼠(H-2q)作为供体,Balb/c(H-2d)或FVB(H-2q)小鼠作为受体,建立小鼠左肺原位肺移植模型。定期检测供体肺散发的生物荧光信号强度。不同的时间点处死实验动物,取出供肺组织行HE染色,观察肺组织病理学改变。结果显示,所有肺移植物均在移植后7天左右排斥,生物荧光信号强度(BLI)在7天左右下降到基础值的5%以下(1.35±0.1%),到移植后2周,移植物生物荧光信号降到背景水平。相反在同基因移植FVB受体小鼠内,生物荧光信号强度在2周仍然超过基础强度的80%(89.6±4.5%)。我们同时使用不同剂量环孢霉素,抑制同种异体小鼠肺移植物的排斥反应,10mg/kg/d、20mg/kg/d和30mg/kg/d,生物荧光信号结果显示,移植术后28天,20mg/kg/d组生物荧光信号强度与基础值相比,远大于10mg/kg/d组(41.05±4%VS14.87±3%,P<0.05),但是和30mg/kg/d组没有很明显的区别(41.05±4%VS44.49±4%,P>0.05)。结论生物荧光显像技术能可靠地活体连续监测小鼠肺移植排斥反应,并能监测环孢霉素的免疫抑制效果,将来临床上可以应用该策略,有利于建立个体化的抗排斥反应治疗方案。第三部分骨髓间充质干细胞对小鼠肺移植急性排斥反应的保护作用目的骨髓间充质干细胞(MSC)具有调节免疫反应的作用。静脉注射后,该细胞大量滞留在肺内,滞留在肺内的细胞是否能够抑制肺移植排斥反应呢?本实验将对此展开研究并探讨其可能的机制。方法实验分两部分,第一部分,检测骨髓间充质干细胞移植后植入到肺内的情况。1X106L2G85来源的骨髓间充质干细胞经尾静脉分别注射至正常组、假手术组以及肺移植组小鼠体内,通过监测生物荧光信号强度来追踪细胞的存活情况(n=5/组)。第二部分,研究骨髓间充质干细胞移植对同种异基因肺移植物排斥反应的保护作用。使用L2G85小鼠为供体,Balb/c小鼠为受体,建立小鼠左肺原位移植模型,随机分成3组,对照组、骨髓间充质干细胞治疗组和环孢霉素治疗组(n=20/组),对照组接受PBS100ul尾静脉注射,共5天；细胞治疗组接受FVB小鼠来源的骨髓间充质干细胞尾静脉注射,1×106/d,共5天；环孢霉素组接受环孢霉素20mg/kg/d腹腔注射直到实验终末时间点。移植术后第7天,处死部分实验动物,切取肺移植物,流式细胞检测移植术后移植肺内浸润的淋巴细胞中CD4+FOXP3+Treg以及CD8+IFN-γ+Tc的比例；肺组织行HE染色观察组织的病理变化；切取受体脾脏,分离脾细胞行酶联免疫斑点实验检测移植受体的免疫反应类型。部分实验动物定期检测供体肺散发的生物荧光信号强度直至移植后第21天。结果第一部分实验,在正常组、假手术组和肺移植组中,小鼠尾静脉注射骨髓间充质干细胞后,生物荧光显像提示早期细胞主要滞留于肺内,左右肺内细胞信号强度基本相同,24h后左右肺内细胞信号强度在三组中均急剧降低,肺移植组左肺下降幅度最小,肺移植组右肺以及假手术组下降幅度其次,正常组下降幅度最大,第三天,除肺移植组左肺可以检测到较强荧光信号外,其他组以及肺移植组右肺,荧光信号强度均降到背景水平；第二部分实验,在移植术后第7天,与基础值对比,骨髓间充质干细胞治疗组生物荧光信号强度与环孢霉素组相近,差异没有显著性(66.7±8% vs 63.9±4.5%)P>0.05,骨髓间充质干细胞组较PBS组生物荧光信号强,差异有显著性(66.7±8% vs 1.62±0.4%)P<0.05,在术后14天,PBS组信号降到背景水平,细胞移植组和环孢霉素组荧光信号强度相似,分别为基础值的(42.3±3.5 vs 46.6±5.4%),细胞移植组和环孢霉素组相比,差异没有显著性,P>0.05,细胞治疗组、环孢霉素组与PBS组相比,差异有显著性,P<0.05。但是到术后21天,骨髓间充质干细胞治疗组荧光信号显著降低,略强于背景水平,为基础值的0.21±0.5%,环孢霉素组荧光信号为基础强度的41.64±3.5%,差异有显著性,P<0.05。移植术后第7天肺移植物病理切片结果显示：骨髓间充质干细胞治疗组和环孢霉素治疗组肺组织结构基本正常,肺泡通气功能良好,但是PBS组显示肺泡塌陷,肺泡间隔增厚,肺间质淋巴细胞浸润。在术后第7天,供肺移植物浸润淋巴细胞中,MSC细胞治疗组CD4+FOXP3+Treg所占比例显著高于PBS组(32.04±2.5%VS15.5±1.7%)P<0.05。CD8+IFN-y+细胞毒性T淋巴细胞所占比例明显低于PBS组(27.6±1.4% VS 55.2±6.7%)P<0.05。酶联免疫斑点实验结果显示,IFN-γ斑点在三组中分别为：PBS组404±35/106细胞,骨髓间充质干细胞组为200+23/106细胞,环孢霉素组为196±26/106细胞,IL-4斑点在三组中分别为：PBS组为38.7±5.4/106细胞,骨髓间充质干细胞组为75±10/106细胞,环孢霉素组为18±2.9/106细胞。结论在此实验中,我们证实了,静脉注射骨髓间充质干细胞后,细胞早期主要滞留在肺内,此后细胞在肺内的荧光信号急剧降低,但是机械通气和肺移植均可以增加细胞在肺内的植入。多剂量骨髓间充质干细胞移植能够抑制肺移植排斥反应,其机制与该细胞诱导调节T细胞的形成,抑制Th1免疫反应,诱导Th2免疫反应有关。这对于将来应用此治疗策略于临床器官移植领域有重要的意义。