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内切木聚糖酶[EC 3.2.1.8]能够打断木聚糖内部的β-1,4糖苷键,催化降解木聚糖。该酶广泛应用于造纸,食品,饲料,纺织以及能源等行业。目前已经从自然界中分离到的酶,以真菌类木聚糖酶活力最高,但是该类酶对于热的耐受力不符合生产实际的要求。因此对于木聚糖酶的研究也就逐渐转向探索酶结构与功能关系,提高酶的各种特性,包括耐热,耐酸,耐碱等。通过对黑曲霉木聚糖酶Xyn(包括α螺旋上游,α螺旋,α螺旋下游,结构简写为Xyn上-αx-Xyn下,P55329)与葡聚糖酶Glu(同木聚糖酶结构简写为Glu上-αg-Glu下,Q60033)的生物信息学分析,发现二者在结构都是由单一α螺旋和多个β折叠片构成的右手半握状结构。又α螺旋对于G/11家族木聚糖酶的性质有较大影响,而Glu的相应结构位置上的α螺旋具有较强热稳定性。因此,将Glu中的α螺旋替换入Xyn中应当能够提高酶分子稳定性。通过融合PCR对Xyn中的α螺旋进行替换,构建出两种融合基因Xyn上-αg-Glu下和Xyn上-αg-Xyn下。将融合基因分别连接p ET-20b表达载体,导入BL21(DE3)中以表达融合蛋白。对表达的蛋白通过钴离子树脂纯化并作性质分析。结果表明:(1)得到了两种具有活性的融合酶Xyn上-αg-Glu下和Xyn上-αg-Xyn下。(2)Xyn上-αg-Glu下的最适温度(Topt)为53℃,较野生型Xyn(Topt 47℃)提高6℃,50℃下半衰期(t1/2)为20min较野生型Xyn(t1/217min)提高了3min。(3)Xyn上-αg-Xyn下的最适温度为40℃较野生型Xyn降低7℃。40℃下半衰期为15min,而野生型Xyn在40℃温育40min后残余活性仍在80%以上。(3)Xyn上-αg-Glu下与Xyn上-αg-Xyn下的Km值分别为49.7mg/ml,47.4mg/ml较野生型Xyn(Km 12.1mg/ml)提高约4倍,说明两种融合酶与底物的亲和力降低。Kcat值分别为71.9s-1,41.9 s-1较野生型Xyn(Kcat 589.7 s-1)分别降低8倍和14倍,说明两种融合酶的催化活性降低。由此可以看出螺旋结构对G/11家族木聚糖酶分子的稳定性有重要作用,而螺旋结构作为分子模块,在各个分子之间可以通用,葡聚糖酶α螺旋能够在木聚糖酶中起到相应的作用。酶分子的稳定性由分子各部分协调完成。以上为木聚糖酶的分子改造提供了新的科研思路。