过氧化物酶(POD)可用于催化过氧化氢氧化有机化合物。天然POD在处理工业废水、分析食品中微量酚、医学临床分析和合成酚类聚合物等许多领域被广泛应用。目前应用最广泛的是辣根过氧化物酶(HRP),天然HRP价格昂贵,而且容易失活,由于其分子较大,所以在酶联免疫分析过程中,抗原和抗体很难结合,难以被标记。因此在酶催化反应中,寻找一种模拟酶和催化体系来代替HRP,并提高模拟酶催化反应灵敏度是当代科学家们关注的焦点。本论文借助甲烷氧化菌素(Mb)的铜配合物具有过氧化物酶活性及纳米金大的比表面积和高的电子翻转速度等特点,采用甲烷氧化菌素功能化纳米金的铜配位组装来设计合成高效POD模拟酶。主要研究内容如下:利用甲基弯菌IMV(Methylosinus trichosporium IMV3011)产生的Mb,通过Cu(Ⅱ)添加过程中Mb的UV-可见光谱及荧光光谱变化,发现配合物中的配体4-羟基-5-硫酰咪唑(HTI)和4-硫酰-5羟基咪唑(THI)可能在金属配合物的高氧化态Mbn-Cu*稳定性中起着至关重要的作用,推测Cu(Ⅱ)与Mb可能存在Mb-Cu、Mb2-Cu和Mb4-Cu三种不同的配位形式,并对三种配位形式的催化能力进行研究,结果发现三种Mb/Cu配合物都具有较强的过氧化物酶活性,而且Mb/Cu不同配位形式影响其酶活性,Kobs分别为6.11×10-4s-1 8.28×10-4s-1和4.16×10-s-1,不同配位的反应速率常数提高了 400～800倍。其中过氧化物酶活性最高的是二配位,这可能是因为Mb2-Cu配合物结构可能更有利于在氧化剂作用下形成过渡态Mb2-Cu*,因此它活性表现为最高,由此确定Mb/Cu的最佳配位方式为Mb2-Cu。利用Mb和Cu之间的不同金属配位作用介导Mb功能化纳米金粒子的组装,构建纳米酶复合体系。向Mb修饰的纳米金中加入适量Cu(Ⅱ)或Mb-Cu诱导,发现Cu(Ⅱ)和Mb-Cu都在AuNPs表面形成了 Mb2-Cu配位,这可能是由于Mb2-Cu形式的Cu(Ⅱ)和Mb之间具有高亲和力。对两种组装形式进行过氧化物酶活性的检测,结果发现它们的Kobs比直接加入Cu(Ⅱ)或Mb-Cu时分别快3个和1个数量级,这说明纳米金的高电子传递能力和纳米簇中多活性中心产生的协同效应可以大大提高模拟酶的催化效率。在此基础上,我们对Mb2-Cu稳定的纳米簇结构进行动力学研究,确定了最佳反应条件:最适pH为7.0,最适过氧化氢浓度为6×10-3mol/L,对苯二酚最适浓度为4×10-4mol/L,反应温度最适为70℃。实验结果表明构建的纳米酶比天然POD稳定性更高,符合一般生物催化剂的催化规律,可以用来作为天然POD的替代物。主要对甲烷氧化菌素功能化纳米金粒子的铜配位组装进行直接电化学研究,讨论了扫速、pH、修饰时间等因素对酶修饰电极的影响,确定最佳电化学反应条件。研究结果表明对于Mb2-Cu介导的纳米金簇修饰电极,当扫速在100 mV/s,pH 7.0,修饰时间16h时是修饰电极的最适组装条件。对Mb2-Cu稳定的纳米金和Mb2-Cu介导的纳米金簇修饰电极进行计时电流响应测试,结果发现两种修饰电极在5.0×10-5～5.O×10-4mol/L浓度范围内,电流与H202浓度之间线性关系良好,表观米氏常数分别为0.805mmol/L和0.793mmol/L,该数值较小,说明两种自组装电极对于H202的还原都具有高亲和力,对H202的检出限分别为1.1×10-5 mol/L和0.9×10-5 mol/L。综上所述,我们有理由认为Mb2-Cu介导的纳米金簇比Mb2-Cu稳定的纳米金具有更高的过氧化物酶催化活性,该结果与溶液中得到的结论一致。