论文Ⅰ 肠道菌群在高盐饮食引起的高血压发病中的作用研究1研究背景高血压是最常见的慢性病之一,近年来发病率迅速增加。根据2017年美国高血压指南的定义(收缩压(systolic blood pressure,SBP)≥130 mmHg,舒张压(diastolic blood pressure,DBP)≥80 mmHg),45.6%的美国人患有高血压。在我国即使按宽松的标准(SBP≥140 mmHg,DBP≥90 mmHg),也有近一半成人(44.7%)是高血压患者,而2014年这一比例只有29.6%。我国数亿高血压患者只有约30%接受了治疗,但血压(blood pressure,BP)控制达标的患者仅有7.2%,而全球的高血压控制率也不超过10%。高血压已成为一个全球性的公共卫生问题,是导致心血管疾病、脑血管疾病以及肾脏疾病的重要独立危险因素,控制高血压的发生发展是人类健康事业的重要一环。目前抗高血压药物包括利尿剂、钙通道阻滞剂(calcium channel blockers,CCB)、β受体阻滞剂和血管紧张素II受体拮抗剂等5大类60多种,但仍面临患者治疗率低、依从性差、达标率低以及药物不良反应大、易产生耐药等各种困难。高血压的发病机制复杂,目前认为主要与各种原因使中枢交感神经系统活性亢进、肾性水-钠潴留、肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS)激活、大动脉和小动脉结构和功能变化以及胰岛素抵抗、免疫系统失调有关。根据发病原因是否明确,高血压分为原发性高血压和继发性高血压,其中病因明确的继发性高血压仅占5%,而病因不明的原发性高血压高达95%。原发性高血压是一种多因素、多环节、多阶段和个体差异较大的疾病,是遗传与饮食、吸烟、精神应激等环境因素交互作用的结果,合理控制饮食是高血压治疗的一项重要原则,而限制钠盐摄入是饮食控制中的重中之重。我国高血压病具有北高南低的特点也与北方多高盐饮食有关。高盐高血压发病机制复杂,目前认为主要由肾脏水钠异常潴留、血容量升高及外周血管阻力增加引起。一些遗传因素(如GNB3,ADD1和ACE等的多态性)也影响对高盐的敏感性,但引起这些病理改变的具体机制仍未完全阐明。已报道的机制包括:RAAS、交感神经系统和激肽释放酶-激肽系统的异常激活;内分泌系统(包括雄激素和胰岛素抵抗)与高盐的相互作用;一氧化氮信号通路和血管内皮糖萼层受损以及氧化应激增强引起的血管内皮功能障碍等。尽管如此,高盐高血压的确切发病机制仍然需要更多的科学实验进一步研究。人类肠道共生着约1013-1014个细菌(即肠道菌群),是影响遗传易感个体发生多种疾病的重要环境因素。肠道菌群在胃肠道中定殖,而结肠因其独特的厌氧、高营养环境成为肠道菌群的优选定植位点。肠道菌群不仅能在宿主的食物消化方面发挥重要作用,还能执行其他许多重要功能并且与宿主进行相互作用。近年大量研究表明肠道菌群与代谢疾病、免疫学疾病、神经系统疾病密切相关。早期研究显示无菌大鼠BP升高,提示肠道菌群可能参与BP调节。最近的研究发现高血压动物肠道菌群的多样性和丰富度显著降低,产生短链脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs,如乙酸和丁酸)的细菌显著减少,而产Lactobacillus、促炎菌和机会致病菌显著增加。SBP与产乳酸的Lactobacillus的丰度正相关,而与产SCFAs的Odoribacter和Holdemania的丰度负相关。移植高血压动物的肠道菌群能显著升高正常动物的BP,反之则降低高血压动物的BP。全球50%以上的原发性高血压是盐敏感性高血压,但目前对其与肠道菌群关系的研究仍然很少。Mell等发现盐敏感的高血压和耐盐的正常BP的Dahl大鼠盲肠菌群组成有显著差异;移植前者的肠道菌群并不引起耐盐鼠的BP变化,但将耐盐鼠的肠道菌群移植给前者,则使前者BP升高,生存期缩短;而且抗生素处理也不能降低前者的BP。这与其它研究差别很大,可能与盐敏感与耐盐Dahl大鼠的遗传背景差异较大有关。最近Wilck等的研究发现高盐饮食能升高FVB/N小鼠BP,降低其肠道菌群多样性,使Rothia,Clostrdium ⅩⅣa和Lactobacillus等细菌明显减少,而Parasutterella菌增加。特别是Lactobacillus murinus,在体外其生长受高盐抑制,在小鼠和人体内则在高盐饮食时消失,正常饮食时又恢复正常。口服L.murinus能减轻高盐诱导的小鼠高血压,其机制在于Lactobacillus能代谢饮食中的色氨酸产生吲哚,从而抑制T淋巴细胞向TH17细胞分化,减轻免疫炎症。值得注意的是,既往关于肠道菌群和高盐高血压的研究发现的高盐饮食诱导的差异肠道菌和肠道代谢物并不完全相同,可能与研究所用动物的品系、高盐喂养时间、饲料配方、分析平台及方法不一致有关。这也说明高盐高血压的发病机制复杂,是否仍有其他细菌和代谢物在高盐高血压的发生发展中发挥作用仍然需要进一步的科学试验加以研究。因此,本研究计划以wistar大鼠为研究对象,给以高盐饮食4周,通过肠道菌群移植明确肠道菌群变化与BP变化的因果关系,收集外周血和大便,用16S rRNA测序确定菌群结构异常,用非靶向代谢组学分析确定其肠道中的代谢异常。阐明肠道菌群在高盐高血压发生发展的作用及机制。2目的(1)高盐饮食诱导wistar大鼠BP升高,通过菌群移植明确BP升高与菌群变化的因果关系;(2)利用16s rRNA测序和非靶向代谢组学等技术明确揭示肠道菌群在高盐高血压中的作用和机制。3方法3.1建立动物模型及给于药物处理高盐饲料诱导大鼠高血压:选4周龄正常Wistar雄性大鼠,实验组用高盐(8%NaCl)饲料喂养诱导高血压,正常对照组用低盐(0.49%NaCl)饲料喂养。每周测量大鼠BP,以SBP≥130mmHg或DBP≥80 mmHg作为是否高血压的标准,我们前期研究结果显示诱导成功率超过95%0(58/60)。随机分组如下:低盐对照组(A 组,control(n=32):分为 A1(n=16),A2(n=16)高盐高血压组(B 组,HSD(n=32):分为 B1(n=16),B2(n=16))3.2大鼠肠道菌群移植(1)移植方案●E组:A1接受B1组菌群●F组:B2接受A2组菌群(2)清除肠道菌群用四联抗生素混合物(1 g/L ampicillin,500 mg/L vancomycin,1 g/L neomycin sulfate,1 g/L metronidazole)连续灌胃3周清除受体鼠肠道菌群,管饲液体剂量为2.5ml/kg。管饲前将抗生素混合物溶液充分混匀。移植肠道菌群的前48小时停药。(3)制备供体鼠肠道菌群悬液并移植麻醉后处死供体鼠,在无菌手术台内立即收集结肠内容物,少量多次加入无菌生理盐水(共约20ml),用无菌玻璃棒研磨内容物使其尽可能溶于生理盐水。将混悬液通过200目筛网过滤以清除食物残渣。将滤液于4℃,6000g条件下离心20min,收集沉淀重悬于12ml 10%无菌甘油溶液中制备成悬浮液,于-80℃冰箱中保存备用。上述操作均在无菌条件下进行的。向相应的受体大鼠每2天管饲一次来自供体大鼠的结肠内容物悬液(200 mg/ml),每次1ml,3次。每周两次监测BP。3.3血压测量(1)尾量尾袖法测量血压各组大鼠分别于高盐(或正常盐)饮食前、高盐(或正常盐)饮食后、抗生素后、移植后用尾袖法测量大鼠BP,提前5天适应性测量,每次测量均测量三次,间隔30秒,三次测量数据取平均值作为本次测量的BP结果。(2)遥测法测量血压●血压植入子植入手术操作动物手术前24小时需禁食、不禁水,使用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉诱导完全麻醉状态。用蒸馏水配制2%戊二醛水溶液,将植入子完全浸泡其中,加盖,浸泡12-24小时,无菌操作取出,用灭菌水冲洗干净后备用。记下植入子编号。按照无菌操作原则将植入子插入腹主动脉内,快速覆盖纤维素膜并添加少量粘合剂,确保穿刺口无渗血。将动物转移至接收板,软件内输入校正值后查看波形,波形正常后取出纱布条和提拉线,清理腹腔,将植入子固定于腹腔肌肉层,并缝合好伤口。手术后将动物保温,直到动物清醒。手术后4-6小时等动物排便后再喂食,防止术后胃肠於张引起死亡。●收集数据按照说明书连接好设备各组分,将带有植入子的动物放在接收板上,指示灯亮,即可开始采集数据。3.4静脉血及粪便样本收集及处理(1)收集及处理静脉血利用活结将大鼠以“十字架”型、仰卧位固定于固定板上(头部朝上,两前肢成一条直线且与躯干垂直),用酒精棉球沿同一方向擦拭。沿上肢下沿划一横线,沿颈根部外侧划一竖线,交点即为进针点。用带有0.6号蓝色针头的2ml注射器进行穿刺,与躯干成30°水平进针,一旦针头进入皮下组织,立即轻微外抽活塞轴形成管内的负压状态,约到达锁骨上方针头呈30度角向下刺,当血液进入注射器,固定注射器并保持负压,直到在注射器中收集到所需的血液量(1 ml)。采血后,拔出穿刺针,并用棉签轻轻按压穿刺部位1-2分钟以止血。整个过程大鼠均为清醒状态,若5分钟内未能取血成功应该将大鼠解绑并放回鼠笼,稍后再试。将血液样本迅速转移到抗凝管中,3000rpm,15min离心收取上清,于-80℃保存备用。(2)收集及处理粪便样本实验人员带好防护手套单手固定大鼠,酒精棉球消毒肛门附近皮肤,通过直肠按摩手法促使大鼠排便,并用无菌组织冻存管于肛门处直接收取粪便颗粒(每次取2-3粒粪便)。装有粪便颗粒的冻存管立即放入液氮速冻并尽快转移至-80℃冰箱保存备用。整个过程应注意避免管口与肛门皮肤接触,避免杂菌污染。3.5 16s rRNA基因测序及分析以各组肠道菌群gDNA为模版,PCR扩增16S rRNA基因的v3-v4区,纯化后再用PCR加入接头序列,定量后测序,测序量>20万序列/样品。原始数据经去除接头和低质量碱基等处理后生成有效数据,用于后续分析。综合Qiime2、USearch和Calypso等工具确定扩增子序列变体(AVS)并进行注释和差异分析,揭示各组肠道菌群的组成特征。然后用聚类、PCA和PcoA等特征提取工具,比较硝苯地平前后肠道菌群的多样性、种类和丰富度等特征。3.6非靶向代谢组学分析用1 mL甲醇提取大约100 mg的粪便,并添加60 μ L2-氯-L-苯丙氨酸和庚二酸作为内标。涡旋,超声处理和离心后,将上清液转移到新管中并干燥。依次加入60p L15 mg/mL甲氧基胺吡啶和N,0-双(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺试剂,于37℃孵育。离心后,根据制造商说明书,使用ACQUITY UPLC系统(Waters Corporation,Milford,美国)结合 AB SCIEX Triple TOF 6600 系统(AB SCIEX,Framingham,MA)以正离子和负离子模式进行分析。将所有代谢物离子归一化,并通过SIMCA 14.0(Umetrics,Umea,瑞典)和XCMS 1.50软件进一步分析离子(RSD%<30%)。正交偏最小二乘判别分析(Orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)及其验证是在通过 SIMCA 进行平均居中和单位方差缩放后进行的。根据从OPLS-DA模型获得的对投影(VIP)值(>1)和对标准化峰面积进行的Wilcoxon秩和检验的p值(<0.05)的组合,选择差异峰特征。保留至少一组中非零值超过50%的峰特征,并通过HMDB,METLIN和大连化学数据解决方案信息技术有限公司建立的参考材料数据库将其用于鉴别差异代谢物。代谢云图是使用 XCMS online 生成的(https://xcmsonline.scripps.edu/)。3.7整合分析多维数据,发现并筛选与离盐高血压有关的细菌及代谢物将各组大鼠16s rRNA测序、代谢组的组学数据、BP等指标数据统一成二维表达矩阵,然后采用WGCNA、特征选择和因子分析等生物信息学方法以及R多变量分析工具,整合分析上述多维数据,发现与高盐高血压相关的肠道细菌及相应的代谢物。3.8酶联免疫吸附实验(ELISA)ELISA用于检测血清中炎性因子水平。所有实验均按照说明书操作。测定内和测定间变异系数分别控制在10%和15%以内。ELISA的所有样品均一式两份运行。3.9实时定量PCR验证肠道菌水平如前所述,使用CTAB方法从粪便样品中提取gDNA。然后,在CFX96实时PCR系统(Bio-Rad)上使用TB Green Premix Ex Taq(TaKaRa)和特异性引物(表S3)进行定量PCR。3.10统计学分析数据用平均值±标准误或中位数(最小到最大)表示。Shapiro-Wilk检验用于评估数据的正态性。对于符合正态分布的数据,两组之间的比较和多组比较分别使用t检验和单因素方差分析,单因素方差分析用事后检验(Turky或Dunnett)进行多重校正。对于不符合正态分布的数据,两组之间的比较和多组比较分别使用Wilcoxon秩和检验和Kruskal-Wallis检验,Kruskal-Wallis检验用事后检验(Dunn)进行多重矫正。为了对包括代谢组学和16S rRNA基因测序数据在内的组学数据进行某些多重比较或统计分析,在FDR<5%条件下,使用经Benjamini-Hochberg方法调整的t检验或Wilcoxon秩和检验。使用GraphPad Prism v8 和 R 软件包进行统计分析。p<0.05 或 adjusted p<0.05 被认为具有统计学意义。所有实验至少重复三次。4实验结果4.1高盐饮食能显著诱导W i star大鼠发生高血压用高盐(8%NaCl)饲料喂养正常Wistar雄性大鼠诱导高血压(HSD组),正常饲料喂养作为control组。在喂养期间,2组大鼠体重均升高,但组间没有明显差异。随着高盐喂养时间的延长,HSD组大鼠BP逐渐升高,在第4周SBP达到 167.9± 13mmHg,DBP 125.4±17mmHg,显著高于同周龄 BP 正常的 control 组大鼠(101.7±10/76.5±9mmHg),达到高血压标准。4.2高盐饮食使大鼠肠道菌群生态明显失调16s数据的主成分分析(Principal component analysis,PCA)和主坐标轴分析(Principal coordinate analysis,PCoA)均发现 control 和 HSD 组大鼠肠道菌群出现明显分离,表明两组大鼠的肠菌群特征显著不同。与control组大鼠相比,HSD 组大鼠肠道菌群的Firmicu tes/Bac teroride tes比例(F/B ratio)发生严重的肠道菌群的生态失调。除了Firmicu tes和Bacteroridetes明显变化外,高盐高血压大鼠肠道中spirochaete比例大幅增加,而Verrucomicrobia明显降低。4.3高盐饮食显著改变了大鼠肠道菌群之间的共生关系肠道细菌之间存在复杂的共生关系和相互作用。共同网络分析的结果表明4周的高盐喂养细菌之间的共生关系,高盐的摄入使某些益生菌之间的相互作用被打破。很多这些丰度显著改变的细菌与BP升高关系密切。4.4高盐饮食诱导的高血压大鼠肠道菌群中乳酸杆菌属和Bacteroides属显著减少高盐饮食后大鼠肠道共有31个菌属或种的丰度显著变化,其中22个AVS簇的丰度显著降低。细菌丰度与BP的Spearman相关性分析也发现在差异AVS中,Bacteroride tes 的所有差异细菌、Firmicutes 中的 Lactobacillus 与 SBP、DBP显著负相关,与BP显著负相关。并且在丰度最高的前十种差异肠道菌中,Bacteroides的丰度远高于其它菌属,这提示它在高盐诱导的高血压发病中可能发挥更重要的作用。4.5高盐饮食HSD显著改变了肠道菌群的代谢谱OPLS-DA表明control组和HSD组的代谢数据簇彼此分离。在ES+和ES-模式下,分别有955和641个峰特征的峰强度发生了显著变化。这些结果表明HSD显著改变了肠道菌群的代谢谱。4.6多种代谢物与血压和差异菌显著相关肠道差异菌丰度、BP与许多代谢产物水平之间存在显著相关性(|r|>0.5,FDR-adjusted p<0.05)。例如,二氢速固醇和乙酰胆碱与SBP和DBP显著负相关,而分别与Odoribacter和Flexispira显著正相关和负相关。前列腺素E2和白三烯B4与BP呈强正相关,与Distasonis和Psychrobacter分别呈显著负相关和正相关。值得注意的是,HSD组肠皮质酮浓度增加了 4.4倍。皮质酮与某些高度丰富的细菌(如Bacteroides,Lactobacillus)显著负相关。此外,它也与SBP和DBP显著正相关(图4E)。4.7高盐饮食诱导的高血压可经肠道菌群移植传递HSD组大鼠升高的SBP和DBP在抗生素处理后都显著下降,而进一步移植BP正常的正常饮食的control组大鼠肠道菌群后,它们的BP又进一步明显下降到近正常水平。相反的,抗生素处理正常饮食的control组大鼠仅使其SBPSBP显著升高,对DBP的升高作用不显著。但进一步移植高血压的HSD大鼠的肠道菌群后,其SBP和DBP都升高非常显著。这些结果说明高盐饮食引起的大鼠肠道菌群异常是高盐导致高血压的原因和机制之一,而不仅仅是这一过程中的伴随现象。5结论(1)高盐摄入使wistar大鼠BP升高,升高的BP可经FMT传递;(2)高盐摄入显著改变高盐高血压大鼠的肠道菌群组,降低肠道Bacteroides水平;(3)高盐摄入显著改变高盐高血压大鼠的肠道菌群代谢普,降低肠道及血清皮质酮水平。论文 Ⅱ 肠道菌群调节的肠源性皮质酮在高盐高血压中的作用及机制研究1研究背景高血压是最常见的慢性病之一,在我国有近一半成人(44.7%)是高血压患者(收缩压(systolic blood pressure,SBP)≥140 mmHg,舒张压(diastolic blood pressure,DBP)≥90 mmHg),而这一比例在 2014 年只有 29.6%。高血压能引起心、脑、肾和血管等重要组织脏器结构和功能的障碍,是中风、心梗和心衰等恶性心脑血管事件的最主要的危险因素,每年在全球导致至少45%的心脏病死亡和51%的脑卒中死亡,已成为全球最严重的公共卫生问题之一。高血压发病机制复杂,已报道的机制包括肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)异常激活,交感神经和激肽释放酶-激肽系统,以及血管内皮功能障碍。在这些机制中,皮质激素和盐皮质激素受体(MR)功能障碍对于高血压的发展至关重要,尤其是盐敏感性高血压。糖皮质激素(即人类的皮质醇,啮齿动物的皮质酮)在多种生理和病理过程中起着重要作用。肾上腺皮质是皮质酮和皮质醇合成和释放的主要部位。但是,用于固醇合成的许多关键酶也在肠道上皮,胸腺,大脑和其他能够合成生物活性糖皮质激素的组织中表达。在生理条件下,肠产生的皮质酮非常低,但在炎性环境中会显著增加。在经过肾上腺切除术的肠道细菌耗竭的小鼠中,肠源性皮质酮甚至可以使血浆皮质酮水平恢复到正常水平。皮质酮,皮质醇和醛固酮是体内钠和钾稳态,血液动力学和血压(BP)的主要调节剂。所有这些激素均可激活MR,导致钠潴留和BP升高。因此,这些激素的异常升高与高血压的发生密切相关。肠道菌群与多种疾病密切相关。最近的研究表明,患有高血压的患者和动物的肠道菌群发生了重大变化,包括产生短链脂肪酸(SCFAs)的细菌减少以及促炎性细菌和机会性病原体的增加。通过移植患有高血压的患者或动物的肠道菌群,可以显著提高健康动物的BP。一些益生菌或益生元也可以降低患有高血压的患者或动物的BP。但是,关于肠道菌群与高血压之间关系的机制的研究还很少。最近,Wilck等已经发现HSD可以显著降低高血压FVB/N小鼠的肠道粘液性Lactobac11lus,而粘液性Lactobacillus可以通过饮食中的色氨酸代谢产生引哚,从而抑制T淋巴细胞分化为Th17细胞,减轻炎症和降低BP。我们的前期研究结果也发现hSIH可以通过粪便菌群移植进行转移,表明肠道菌群在hSIH发育中具有关键作用。HSD降低了肠道中的Bacteroides属的水平,增加了粪便皮质酮浓度,而Bac teroides及皮质酮水平与BP彼此显著相关。然而,Bac teroiades属及粪便中的皮质酮是否真的在高血压的发展中起重要作用以及其中的具体机制尚需要更多研究来阐明。2目的(1)研究Bac teroides和肠道皮质酮在高血压中的角色,揭示Bacteroides和皮质酮在高血压大鼠及患者中的变化趋势;(2)研究Bac teroides和皮质酮的具体关系,揭示Bacteroides如何调控皮质酮以及两者在高血压的发展中的具体机制。3方法3.1建立动物模型及给于药物处理高盐饲料诱导大鼠高血压:选4周龄正常Wistar雄性大鼠,实验组用高盐(8%NaCl)饲料喂养诱导高血压,正常对照组用低盐(0.5%NaCl)饲料喂养。每周测量大鼠BP,以SBP≥130mmHg或DBP≥80 mmHg作为是否高血压的标准,我们前期研究结果显示诱导成功率超过95%(58/60)。随机分组如下:低盐对照组(control(n=32))高盐高血压组(HSD(n=32))3.2尾袖法测量血压各组大鼠分别于高盐(或正常盐)饮食前、高盐(或正常盐)饮食后、抗生素后、移植后用尾压法测量大鼠BP,提前5天适应性测量,每次测量均测量三次,间隔5分钟,三次测量数据取平均值作为本次测量的BP结果。3.3 样本收集及处理(1)临床样本收集●临床病例纳入及排除标准根据高血压指南(新ACC/AHA高血压指南,2017)诊断标准,我们从山东大学齐鲁医院招募了 11名未经治疗的高血压患者(SBP≥130 mm Hg,或DBP≥80 mm Hg)和12名健康人。排除标准如下:妊娠,腹泻;在3个月内使用以下药物:抗生素,益生菌,益生元,泻药,中草药和胃肠道手术。两组受试者的年龄,性别,体重指数(BMI)等均相匹配。●收集及处理静脉血样本禁食过夜(≥8 h)后于早晨采集5 mL外周血,将血液样本迅速转移到抗凝管中,3000rpm,15min离心收取上清,于-80℃保存备用。●收集及处理粪便样本所有受试者均配备了便桶标本采集套件,用于粪便采集。每位受试者采集约2g新鲜粪便,置于液氮速冻,并迅速转移至-80℃保存备用。用QIAamp DNA Stool Mini Kit纯化180mg大便样品中的肠道菌群gDNA,另外180mg大便样品用PBS溶解,反复冻融并匀浆后16000g,4℃离心10分钟;沉淀用不同浓度的PBS-乙腈萃取,每次用16000g,4℃离心10分钟后取上清,并用0.2um滤膜过滤,最后将每次离心的上清合并后-80℃贮存用于代谢物分析。(2)大鼠样本收集●收集处理大鼠静脉血利用活结将大鼠以“十字架”型、仰卧位固定于固定板上(头部朝上,两前肢成一条直线且与躯干垂直),保证捆绑线松紧适宜且充分暴露胸骨、颈部等位置,用酒精棉球沿同一方向擦拭,可见两侧颈静脉窦,并有轻微的跳动。沿上肢下沿划一横线,沿颈根部外侧划一竖线,交点即为进针点。用带有0.6号蓝色针头的2ml注射器进行穿刺,与躯干成30°水平进针,一旦针头进入皮下组织,立即轻微外抽活塞轴形成管内的负压状态,约到达锁骨上方针头呈30度角向下刺,当血液进入注射器,固定注射器并保持负压,直到在注射器中收集到所需的血液量(1 ml)。如果没有血液流入注射器,则将其停止。然后慢慢抽回注射器并保持负压。在大多数情况下,抽回时血液会进入注射器。采血后,拔出穿刺针,并用棉签轻轻按压穿刺部位1-2分钟以止血。整个过程大鼠均为清醒状态,若5分钟内未能取血成功应该将大鼠解绑并放回鼠笼,稍后再试。将血液样本迅速转移到抗凝管中,3000rpm,15min离心收取上清,与-80℃保存备用。●收集处理大鼠粪便样本实验人员带好防护手套单手固定大鼠,酒精棉球消毒肛门附近皮肤,通过直肠按摩手法促使大鼠排便,并用无菌组织冻存管于肛门处直接收取粪便颗粒(每次取2-3粒粪便)。装有粪便颗粒的冻存管立即放入液氮速冻并尽快转移至-80℃冰箱保存备用。整个过程应注意避免管口与肛门皮肤接触,避免杂菌污染。用QIAamp DNA Stool Mini Kit纯化180mg大便样品中的肠道菌群gDNA,另外180mg大便样品用PBS溶解,反复冻融并匀浆后16000g,4℃离心10分钟;沉淀用不同浓度的PBS-乙腈萃取,每次都用16000g,4℃离心10分钟后取上清,并用0.2um滤膜过滤,最后将每次离心的上清合并后-80℃贮存用于代谢物分析。3.4 Bacteroides fragilis的选择性培养和物种鉴定将来自对照组成年雄性大鼠的一克粪便样品在厌氧M2GSC培养基中匀浆。离心并连续10倍稀释后,将0.3 ml悬浮液在均涂于1.5%M2GSC琼脂平板上,在37℃的环氧环境下孵育48 h。挑选单个菌落,转移至装有10 ml M2GSC的培养瓶中,在37℃的环氧环境下孵育过夜。然后,提取分离细菌的gDNA,并使用通用 16S 引物用 PrimeSTAR Max Premix(TaKaRa)扩增全长 16S rRNA 基因。通过Sanger测序对PCR产物进行测序,并使用本地比对搜索工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对测序数据进行比对,鉴定为B.fragilis YCH46。3.5 C57BL/6小鼠结肠组织体外培养四周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为两组。对照组为正常饲养的C57B1/6小鼠,高盐组为8%高盐饲料喂养辅以管饲3%盐水1天的C57B1/6的小鼠。安乐死后,在无菌条件下获得结肠段,并用含10%FBS和抗生素的DMEM洗涤。将小块干净的结肠段转移到含有培养基的无菌12孔板中,并在37℃下孵育2小时。洗涤后,根据实验分组,将不同的溶液,例如M2GSC培养基,易碎芽孢杆菌YCH46(BfS)在 M2GSC 培养基,AA(Acros,0.25 μmol/L),DHA(ApexBio,0.25 μmol/L)或EPA(ApexBio,0.25 μmol/L)加入培养的结肠组织块中12 h。然后收集结肠组织和培养物上清液。上清液3000rpm,15min离心收取上清,结肠组织提取RNA,进行逆转录。将样品保存在-80℃尽快使用。3.6实时定量聚合酶链反应使用TRIzol试剂(Invitrogen)提取组织总RNA,并使用PrimeScript RT试剂盒(TaKaRa)进行逆转录。另外,使用CTAB方法从粪便样品中提取gDNA。然后,在 CFX96 实时 PCR 系统(Bio-Rad)上使用 TB Green Premix Ex Taq(TaKaRa)和特异性引物进行定量聚合酶链反应。检测组织Mr、Cyp11a1、Cyp11b1、Hsd11b1、Hsd11b2,以及粪便脆弱Bac teroides的含量。3.7酶联免疫吸附实验(ELISA)ELISA用于检测结肠段,血清和粪便的培养上清液中花生四烯酸,皮质酮,醛固酮和20-HETE的水平。所有实验均按照说明书操作。测定内和测定间变异系数分别控制在10%和15%以内。ELISA的所有样品均一式两份运行。3.8统计分析数据用平均值±标准误或中位数(最小到最大)表示。Shapiro-Wilk检验用于评估数据的正态性。对于符合正态分布的数据,两组之间的比较和多组比较分别使用t检验和单因素方差分析,单因素方差分析用事后检验(Turky或Dunnett)进行多重校正。对于不符合正态分布的数据,两组之间的比较和多组比较分别使用Wilcoxon秩和检验和Kruskal-Wallis检验,Kruskal-Wallis检验用事后检验(Dunn)进行多重矫正。为了对包括代谢组学和16S rRNA基因测序数据在内的组学数据进行某些多重比较或统计分析,在FDR<5%条件下,使用经Benjamini-Hochberg方法调整的t检验或Wilcoxon秩和检验。使用GraphPad Prism v8 和 R 软件包进行统计分析。p<0.05 或 adjusted p<0.05被认为具有统计学意义。所有实验至少重复三次。4结果4.1高盐饮食使丰度最高的Bacteroides属细菌减少利用RT-qPCR技术发现与对照组相比,Bacteroides属在高血压大鼠和患者肠道中显著下降。从健康大鼠粪便中分离培养出Bacteroides,经sanger测序鉴定为脆弱BacteroidesYCH46,RT-qPCR发现脆弱BacteroidesYCH46在高血压大鼠和患者肠道中显著下降。说明脆弱Bacteroides在高血压的发生发展中可能发挥重要作用4.2高盐饮食显著升高粪便及血清的皮质酮水平利用ELISA技术测定高血压大鼠血清和粪便的皮质酮水平,发现与对照组相比,高盐饮食显著升高大鼠血清和粪便的皮质酮水平,与临床样本结果一致。考虑到皮质酮能结合并激活盐皮质激素受体,与RAAS系统密切相关,我们检测醛固酮的血清水平,发现与既往研究结果一致,高血压大鼠和患者的血清醛固酮水平显著低于相应对照组。说明皮质酮在高盐高血压中的作用不容忽视。4.3高盐饮食显著升高肠源性皮质酮既往研究发现,肠道是合成活性皮质酮的重要场所,肠道来源的皮质酮除了在原位发挥作用外,还可进入血液发挥全身作用。我们发现与对照组相比,高血压大鼠结肠组织皮质酮合成关键酶(Cyp11a1、Cyp11b1、Hsd11b1)的mRNA水平显著升高,而可降解皮质酮的Hsd11b2和Mr的mRNA水平显著下降。ELISA结果证实高盐处理使结肠组织合成的皮质酮显著增加。4.4脆弱Bacteroides可以逆转高盐诱导的肠源性皮质酮的增加我们用分离培养的脆弱Bac teroidesYCH46的培养上清处理体外培养的结肠组织,发现脆弱Bac teroiades的上清液显著逆转高盐饮食诱导的Cyp11a1、Cyp11b1、Hsd11b1、Hsd11b2、Mr的mRNA的变化,逆转高盐诱导的结肠衍生皮质酮的增加,说明脆弱Bac teroides可调控肠源性皮质酮的合成。但是具体通过何种机制逆转并不清楚。4.5脆弱Bacteroides可产生花生四烯酸,花生四烯酸可逆转高盐诱导的肠源性皮质酮的增加相关性分析发现脆弱Bacteroides、皮质酮与花生四烯酸四烯酸显著相关,而花生四烯酸与BP显著相关,可以合理假设花生四烯酸可能介导脆弱Bacteroides对结肠皮质酮的调控。我们用花生四烯酸刺激体外培养、经不同处理的结肠组织,发现与Bacteroides上清液作用一致,花生四烯酸显著逆转高盐饮食诱导的Cyp11a1、Cyp11b1、Hsd11b1、Hsd11b2、Mr的mRNA的变化,逆转高盐诱导的结肠衍生皮质酮的增加。而ELISA证实脆弱Bacteroides可以产生花生四烯酸,并且花生四烯酸在高血压大鼠和患者肠道中的水平显著高于相应的对照组。说明花生四烯酸使介导脆弱Bac teroides调控结肠皮质酮的重要因子。4.6 B.f ragilis和AA可以降低HSD大鼠血压我们对高盐高血压大鼠补充脆弱Bacteroides和花生四烯酸,改用硫酸镁进行肠道准备辅助移植。我们发现补充B.fragilis YCH46可使SBP降低约17.3±2.3mmHg,DBP 降低约 20.7±0.8mmHg,补充AA使SBP降低 16.8±1.1mmHg,DBP降低18.3±1.7mmHg。尽管BP未达到正常水平,但与同期HSD组相比,差异具有统计学意义。并且在停止灌胃后第7天(41d),SBP和DBP均略有增加,B.fragilis仍使SBP和DBP明显低于HSD组。5结论(1)高盐饮食显著增加结肠衍生的皮质酮水平。(2)脆弱Bacteroides上清液可以逆转高盐诱导的结肠皮质酮的增加。(3)脆弱Bacteroides能够产生花生四烯酸,花生四烯酸可以逆转高盐诱导的结肠皮质酮的增加。论文Ⅲ 肠道菌群在硝苯地平抗高盐诱导的高血压中的作用及机制研究1研究背景高血压是最常见的慢性病之一,在我国有近一半成人(44.7%)是高血压患者(收缩压(systolic blood pressure,SBP)≥ 140 mmHg,舒张压(diastolic blood pressure,DBP)≥90 mmHg),而这一比例在 2014 年只有 29.6%。高血压能引起心、脑、肾和血管等重要组织脏器结构和功能的障碍,是中风、心梗和心衰等恶性心脑血管事件的最主要的危险因素,每年在全球导致至少45%的心脏病死亡和51%的脑卒中死亡,已成为全球最严重的公共卫生问题之一。目前高血压仍以药物治疗为主,抗高血压药物包括钙通道阻滞剂(CCB)、血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)、利尿剂、β受体阻滞剂、血管紧张素II受体拮抗剂(ARB)共5大类60多种,但临床仍面临易产生耐药、药物不良反应大和患者治疗率以及达标率低等问题。如我国数亿高血压患者只有约30%接受了治疗,血压控制达标率仅有7.2%,在全球高血压的控制率也不超过10%。另外,大部分高血压患者都需要两种或更多降压药物才能有效降压,而很多患者即使如此也不能有效控制血压。而且,还有研究显示长期使用ACEI类降压药物能显著增加患者肺癌的发病率。高盐饮食是高血压的独立危险因素,高盐诱导的高血压占所有高血压患者的50%以上,高盐通过何种机制影响BP尚不明确。因此,面对这些问题,亟需对高血压的发病和抗高血压药物的作用机制进行更多研究,从而寻找新的药物治疗方案和策略。肠道是人体内外环境相互作用的主要界面,在这个界面上共生着约1013-1014个细菌(肠道菌群),它们是机体内外环境因素相互作用的重要调控者,在动脉粥样硬化、糖尿病、恶性肿瘤、自身免疫和高血压等多种疾病的发生发展中发挥重要作用。硝苯地平(NF)是CCB的代表药物,也是治疗HSD的首选药物之一。其经典作用机制是抑制电压门控L-型钙通道,阻止钙离子从胞外流向胞内,从而舒张血管、降低心率和心肌收缩力,使BP降低。然而,HSD患者BP波动大、靶器官损害早、心血管事件发生率和病死率更高,往往需要使用一种CCB、利尿剂和一种ACEI/ARB的三联疗法、甚至更多抗高血压药物才能有效降压;而且很多患者即使如此也不能有效控制BP。因此,为解决这些临床问题,有必要深入研究并全面认识这些抗高血压药物的降压机制。很多研究发现多种不属于抗生素的常用药物都有很强的抗菌活性,如抗组胺药、抗高血压药、抗炎药和精神药物等。同样,CCB也有明显的抗生素样活性:如氨氯地平在体外能明显抑制、杀灭4种革兰氏阳性菌属和15种革兰氏阴性菌属共504种细菌,在体内能保护小鼠免受鼠伤寒沙门氏菌的感染。拉西地平在体外能显著抑制233种革兰氏阳性和阴性菌株生长,还有明显的抗霍乱弧菌作用,在体内能显著减少实验兔感染霍乱弧菌的程度和症状。非洛地平、尼莫地平和NF在体外都能明显抑制111种革兰氏阴性菌和220种革兰氏阳性菌的生长。维拉帕米则具有抗结核分枝杆菌的活性,能减少结核分枝杆菌的耐药。这些研究都充分说明包括NF在内的多种临床常用的CCB都有明显的抗菌活性。肠道菌群能通过调控药物在肠道的吸收、排泄和代谢等过程影响药物的疗效和毒副作用。肠道菌群对NF等降压药物在肠道中的吸收、生物利用度和药代动力学特征的影响已有很多研究。但另一方面,如前所述,很多非抗生素类药物有明显的抗菌作用。今年1月的最新研究也表明质子泵抑制剂等19种常用药物都能显著影响肠道菌群。那么对肠道菌群的影响是否与这些药物的疗效有关?是否是药物发挥疗效的重要机制?调整肠道菌群能否作为药物协同增效和减少耐药的手段?等等,这些问题目前的研究仍然不多。近年来发现二甲双胍和阿卡波糖能显著改变T2D患者的肠道菌群组成,抑制炎症反应,从而发挥降糖作用。这与它们经典的药理作用机制是截然不同的,大大拓宽了人们对这些药物作用机制的认识。很多研究已经证明NF等CCB能抑制杀灭多种细菌,HSD患者长期口服CCB,其抗生素样活性必然深刻影响患者肠道菌群的组成和功能,那具体是什么影响?而且,考虑到肠道菌群在(高盐)高血压发生中的重要作用,那么NF等CCB对肠道菌群的影响是否像二甲双胍降低血糖一样,也是它们除了经典机制外发挥降压作用的另一重要途径?这一途径涉及的机制是什么?能否利用这一途径协同改善NF等CCB药物的降压作用?等等,这些问题迄今仍然都不清楚,也未见研究报道。然而,阐明这些问题对解决目前高血压治疗中面临的药物易耐受、患者依从性差等很多问题都有重要价值。2目的(1)研究肠道菌群是否介导硝苯地平的降BP作用;(2)研究硝苯地平是否影响肠道菌群的结构和功能;(3)研究硝苯地平如何影响肠道菌群的结构和功能。3方法3.1建立高盐高血压大鼠模型及药物处理(1)高盐饲料诱导大鼠高血压选4周龄雄性Wistar大鼠,高盐高血压组用高盐(8%NaCl)饲料喂养诱导高血压(HSD),低盐(0.5%NaCl)饲料喂养的大鼠作为正常对照组(NSD)。用鼠尾血压计每周测量大鼠BP,以SBP≥130mmHg、DBP≥80 mmHg作为高血压标准,预实验显示成功率超过95%。(2)实验分组和样本量确定根据实验设计,总共分为组,包括NSD组(n=10)、HSD组(n=32,分为H1组(n=16)、H2 组(n=32))、HSD+NF 组(n=32,分为 N1 组(n=16)、N2 组(n=16))。根据我们已发表的相关工作及预实验数据确定的effect size,使用SAS(版本9.4)的PROC POWER功能计算样本量。将显著水平(a)设为005,将检验效能power 设为 80%。3.2肠道菌群移植(1)移植方案●E组:H1接受N1组菌群●F组:N2接受H2组菌群(2)清除肠道菌群用四联抗生素混合物(1 g/L ampicillin,500 mg/L vancomycin,1 g/L neomycin sulfate,1 g/L metronidazole)连续灌胃3周清除受体鼠肠道菌群,管饲液体剂量为2.5ml/kg。每次管饲前将抗生素混合物溶液充分混匀。进行肠道菌群移植48小时前停药。(3)制备供体鼠肠道菌群悬液并移植麻醉后处死供体鼠,在无菌手术台内立即收集结肠内容物,少量多次加入无菌生理盐水(共约20ml),用无菌玻璃棒研磨内容物使其尽可能溶于生理盐水。将混悬液通过200 μm筛网过滤以清除食物残渣。将滤液于4℃,6000g条件下离心20min,收集沉淀重悬于12ml 10%无菌甘油溶液中制备成悬浮液,于-80℃冰箱中保存备用。上述操作均在无菌条件下进行的。向相应的受体大鼠每2天管饲一次来自供体大鼠的结肠内容物悬液(200mg/ml),每次1ml,3次。每周两次监测BP。3.3尾袖法测量血压各组大鼠分别于高盐(或正常盐)饮食前、高盐(或正常盐)饮食后、硝苯地平后、抗生素后、移植后用尾压法(Tail-cuff法)测量大鼠BP,提前5天适应性测量,每次测量均测量三次,间隔5分钟,三次测量数据取平均值作为本次测量的BP结果。3.4样本收集及处理(1)收集处理大鼠静脉血利用活结将大鼠以“十字架”型、仰卧位固定于固定板上(头部朝上,两前肢成一条直线且与躯干垂直),保证捆绑线松紧适宜且充分暴露胸骨、颈部等位置,用酒精棉球沿同一方向擦拭,可见两侧颈静脉窦,并有轻微的跳动。沿上肢下沿划一横线,沿颈根部外侧划一竖线,交点即为进针点。用带有0.6号蓝色针头的2ml注射器进行穿刺,与躯干成30°水平进针,一旦针头进入皮下组织,立即轻微外抽活塞轴形成管内的负压状态,约到达锁骨上方针头呈30度角向下刺,当血液进入注射器,固定注射器并保持负压,直到在注射器中收集到所需的血液量(1 ml)。如果没有血液流入注射器,则将其停止。然后慢慢抽回注射器并保持负压。在大多数情况下,抽回时血液会进入注射器。采血后,拔出穿刺针,并用棉签轻轻按压穿刺部位1-2分钟以止血。整个过程大鼠均为清醒状态,若5分钟内未能取血成功应该将大鼠解绑并放回鼠笼,稍后再试。将血液样本迅速转移到抗凝管中,3000rpm,15min离心收取上清,与-80℃保存备用。(2)收集处理大鼠粪便样本实验人员带好防护手套单手固定大鼠,酒精棉球消毒肛门附近皮肤,通过直肠按摩手法促使大鼠排便,并用无菌组织冻存管于肛门处直接收取粪便颗粒(每次取2-3粒粪便)。装有粪便颗粒的冻存管立即放入液氮速冻并尽快转移至-80℃冰箱保存备用。整个过程应注意避免管口与肛门皮肤接触,避免杂菌污染。用QIAamp DNA Stool Mini Kit纯化180mg大便样品中的肠道菌群gDNA,另外180mg大便样品用PBS溶解,反复冻融并匀浆后16000g,4℃离心10分钟;沉淀用不同浓度的PBS-乙腈萃取,每次都用16000g,4℃离心10分钟后取上清,并用0.2um滤膜过滤,最后将每次离心的上清合并后-80℃贮存用于代谢物分析。3.5 16s rRNA基因测序及分析以各组肠道菌群gDNA为模版,PCR扩增16S rRNA基因的v3-v4区,纯化后再用PCR加入接头序列,定量后测序,测序量>20万序列/样品。原始数据经去除接头和低质量碱基等处理后生成有效数据,用于后续分析。综合Qiime2、USearch和Calypso等工具确定AVS并进行注释和差异分析,揭示各组肠道菌群的组成特征。然后用聚类、PCA和PcoA等特征提取工具,比较硝苯地平前后肠道菌群的多样性、种类和丰富度等特征。3.6非靶向代谢组学分析用1 mL甲醇提取大约100 mg的粪便,并添加60 μ L2-氯-L-苯丙氨酸和庚二酸作为内标。涡旋,超声处理和离心后,将上清液转移到新管中并干燥。依次加入60 μ L15 mg/mL甲氧基胺吡啶和N,0-双(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺试剂,于37℃孵育。离心后,根据制造商说明书,使用ACQUITY UPLC系统(Waters Corporation,Milford,美国)结合 AB SCIEX Triple TOF 6600 系统(AB SCIEX,Framingham,MA)以正离子和负离子模式进行分析。将所有代谢物离子归一化,并通过SIMCA 14.0(Umetrics,Umea,瑞典)和XCMS 1.50软件进一步分析离子(RSD%<30%)。正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)及其验证是在通过SIMCA进行平均居中和单位方差缩放后进行的。根据从OPLS-DA模型获得的对投影(VIP)值(>1)和对标准化峰面积进行的Wilcoxon秩和检验的p值(<0.05)的组合,选择差异峰特征。保留至少一组中非零值超过50%的峰特征,并通过HMDB,METLIN和大连化学数据解决方案信息技术有限公司建立的参考材料数据库将其用于鉴别差异代谢物。代谢云图是使用 XCMS online生成的(https://xcmsonline.s cripps.edu/)。3.7整合分析多维数据,发现并筛选与钙通道阻滞剂降压作用相关的菌种及代谢物整合分析各组组学和功能指标数据,发现特征菌种及代谢物:将各组大鼠16s rRNA测序、代谢组的组学数据,以及BP等数据统一成二维表达矩阵,然后采用 WGCNA、特征选择和因子分析等生物信息学方法以及Omics skin for SIMCA 14.1多变量分析工具,整合分析上述多维数据,发现与硝苯地平降压作用和炎症改善相关的肠道菌种、功能基因群及相应的代谢物。3.7酶联免疫吸附实验(ELISA)ELISA用于检测血清中炎性因子水平。所有实验均按照说明书操作。测定内和测定间变异系数分别控制在10%和15%以内。ELISA的所有样品均一式两份运行。3.8统计分析数据用平均值±标准误或中位数(最小到最大)表示。Shapiro-Wilk检验用于评估数据的正态性。对于符合正态分布的数据,两组之间的比较和多组比较分别使用t检验和单因素方差分析,单因素方差分析用事后检验(Turky或Dunnett)进行多重校正。对于不符合正态分布的数据,两组之间的比较和多组比较分别使用Wilcoxon秩和检验和Kruskal-Wallis检验,Kruskal-Wallis检验用事后检验(Dunn)进行多重矫正。为了对包括代谢组学和16S rRNA基因测序数据在内的组学数据进行某些多重比较或统计分析,在FDR<5%条件下,使用经Benjamini-Hochberg方法调整的t检验或Wilcoxon秩和检验。使用GraphPad Prism v8 和 R 软件包进行统计分析。p<0.05 或 adjusted p<0.05 被认为具有统计学意义。所有实验至少重复三次。4结果4.1硝苯地平显著降低高盐饮食大鼠的血压水平,改善炎症状态发现与对照组相比,硝苯地平能显著降低高盐饮食诱导的高血压(HSD)大鼠的BP、外周血中炎症因子IL-1 β、IL-17和TNF-a的水平。4.2硝苯地平的降压效果可部分经肠道菌群移植传递把NF治疗后BP正常的HSD大鼠的肠道菌群移植给未治疗的HSD大鼠能显著降低后者BP,而将后者的肠道菌群移植给前者则使前者的BP重新升高。这一结果说明NF的降压作用能通过肠道菌群传递,与肠道菌群关系密切。4.3硝苯地平明显改善由高盐诱导的肠道菌群失衡硝苯地平治疗前后高盐高血压大鼠肠道菌群的16s rRNA测序结果发现硝苯地平在降BP的同时,也明显纠正了高盐高血压大鼠肠道菌群的失衡,使其组成特征向正常菌群的方向改善,如使降低的菌群多样性、Eubacterium和Barnesiella等肠道菌的丰度明显升高;使增加的Dorea longicatena等肠道菌的丰度显著降低。PICRUSt分析结果也表明NF治疗能显著改善高盐高血压大鼠失衡的肠道菌群功能。4.4硝苯地平改变肠道细菌之间的相关关系NF改变了许多肠道细菌之间的相关性。如在HSD大鼠中,益生菌Bacteroides仅与Anaerotruncus、Mucispirillum属显著负相关,与其他细菌没有正相关关系,而NF的治疗使原有的负相关关系消失,而新形成了与Butyricimonas之间的显著成相关;在HSD大鼠肠道中,Baraesillla与其他任何细菌均无显著先惯性,但是 NF 后Barnesillla与Phascolarc tobac terium显著正相关,与Dehalobacterium显著负相关;同样的,HSD大鼠Eubacterium与其他细菌亦无显著相关性,但是NF的治疗使其与Psychrobac ter、En terobacter等显著正相关。4.5高盐饮食诱导的高血压大鼠肠道菌群中乳酸杆菌属和Bacteroides属显著减少NF显著改变了 25种属和/或种水平的细菌,其中Barnesiella、Eubacterium和Dorea等细菌的丰度显著增加,Adlerceutzia、Anaerofus tis等细菌的水平显著下降。4.6硝苯地平显