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肌内脂肪(intramuscular fat,IMF)含量作为评价肉质品质的主要指标之一,在猪肉生产过程中非常重要,研究肌内脂肪细胞的脂肪沉积机制可以为畜牧生产提供数据支持。近年来已经有许多miRNAs在脂肪细胞增殖分化中发挥作用的研究,本实验室前期通过高通量测序筛选出许多与脂肪沉积有关的miRNAs,结合ACSL家族成员在肌肉中的相对表达量的结果,通过靶基因在线预测软件双向预测:差异表达的miR-26a-5p和miR-223-3p与乙酰辅酶A合成酶3(ACSL3)可能存在靶向关系。本试验通过双荧光素报告酶系统验证靶向关系,并利用差速贴壁法分离培养来源于背最长肌的猪肌内脂肪细胞,利用过表达,RT-qPCR等技术分析研究miRNA对猪肌内前体脂肪细胞的分化过程的调控作用。本试验的主要结果:(1)沂蒙黑猪不同组织中ACSLs mRNA表达分析:ACSL1主要在肝脏中表达,ACSL3主要在肝脏和肌肉组织中表达,ACSL4主要在肝脏、脾脏中表达,ACSL5和ACSL6在各组织中表达量都较低;在高、低脂组的肌肉组织中,ACSL1、ACSL3、ACSL4均差异表达且达到显著水平(P<0.01),ACSL5和ACSL6虽有差异但不显著。(2)ssc-miR-26a-5p和ssc-miR-223-3p在高、低脂组肝脏中均差异表达且达到极显著水平,与高通量测序结果一致。在高、低脂组的肌肉组织中,ssc-miR-26a-5p和ssc-miR-223-3p以及基因ACSL3均差异表达且达到显著水平。(3)双荧光素酶系统报告基因试验结果:将野生型的ACSL3 3ˊUTR与miR-26a mimic转染PK15细胞时,检测到的萤火虫荧光素酶信号与海肾荧光素酶信号的比值与其他对照组均相比显著降低(P<0.01)且其他各对照组之间无明显差异,该结果表明,ACSL3 3ˊUTR的种子序列可以与miR-26a-5p的种子序列结合猝灭萤火虫荧光素酶的萤火信号使其与海肾荧光素酶信号的比值降低,从而确定ACSL3与miR-26a-5p存在直接的靶向关系;将ACSL3 3ˊUTR野生型双荧光素酶报告载体与miR-223-3p mimic转染PK15细胞时,检测到的萤火虫荧光素酶信号与海肾荧光素酶信号的比值与其他各对照组之间无显著差异,从而确定ACSL3与miR-223-3p不存在直接的靶向关系。(4)ACSL3 mRNA水平在IMF细胞分化前期逐渐上升,在分化第2d表达达到高峰(P<0.05),随后呈逐渐下降趋势,在6d后进入平台期。(5)转染miR-26a-5p mimic/inhibitor可以影响原代肌内脂肪细胞中ACSL3 mRNA的表达:抑制miR-26a可以显著上调ACSL3 mRNA的表达量(P<0.01),过表达miR-26a可以下调ACSL3 mRNA的表达量。(6)过表达miR-26a可以使脂肪细胞分化标志基因PPARγ、SRREBP-1c表达量显著下调(P<0.01),表明过表达miR-26a-5p可以抑制猪肌内脂肪细胞的分化。(7)过表达miR-26a后,油红O染色鉴定结果与TG含量测定结果均显示合成脂滴显著减少,表明过表达miR-26a-5p可以抑制猪肌内脂肪细胞脂滴合成。结论:miR-26a通过靶向结合基因ACSL3减少肌内脂肪细胞中甘油三酯(TG)的合成;miR-26a可以抑制猪肌内脂肪细胞的分化。研究结果为进一步研究miRNA对猪肌内脂肪沉积影响的机制提供研究基础。