神经营养因子的缺乏和钙激活蛋白酶的活动在耳蜗螺旋神经元延迟性死亡过程中扮演重要的角色。补充外源性BDNF，NT3和使用钙激活蛋白酶抑制剂可减轻继发性神经元坏死。但是由于耳蜗膜迷路屏障的存在，这些大分子的生物制剂很难透入内耳。如何将这些多肽药物安全有效地导入内耳，是治疗耳蜗病变引起的感音神经性耳聋的关键。腺病毒载体介导的基因治疗可以将外源基因带入靶部位，并且稳定长期表达。目前，转基因疗法的开展成为治疗感音神经性耳聋的一条新途径。本论文采用pAdeasy系统，构建人重组BDNF和NT3腺病毒载体，并使用重组腺病毒转染培养的新生大鼠耳蜗，观察重组腺病毒对耳蜗各种类型细胞的转染特性。另外用重组腺病毒预先转染的耳蜗组织，观察腺病毒介导的神经营养因子和钙激活蛋白酶抑制剂对庆大霉素破坏毛细胞引起的耳蜗神经元退行性病变的保护。结果如下：一、采用pAdeasy系统，将BDNF和NT3基因插入腺病毒穿梭载体pAdTrackCMV，与腺病毒骨架基因组pAdeasy-1在大肠杆菌中完成同源重组，构建人重组BDNF和NT3腺病毒，构建的重组腺病毒以1×1010VP/ml<WP=110>转染兔骨髓干细胞，表达标记基因EGFP的阳性细胞几乎达100%。收集转染后的细胞，采用RT-PCR的方法，分析BDNF和NT3 mRNA表达，结果发现转染的骨髓干细胞表达BDNF和NT3 mRNA。经Western Blotting分析，转染的细胞成功表达BDNF和NT3蛋白。 二、耳蜗Corti’s器是由多种不同类型的细胞组成的，这些细胞行使着不同的生理功能。目前对于有关重组腺病毒对耳蜗各种细胞类型的转染特性，还缺乏足够的了解。用重组了报告基因-绿色荧光蛋白的腺病毒（AdV/EGFP），感染出生3天的大鼠耳蜗，观察AdV/-EGFP对体外培养耳蜗组织的转染效率。结果显示，以1×109VP/ml的病毒滴度感染耳蜗，耳蜗不同组织区域的各种类型的细胞均有含绿色荧光的细胞出现，但各种细胞类型对腺病毒感染的敏感性明显不同。耳蜗组织中对腺病毒敏感性最高的是外沟细胞、齿间细胞及耳蜗间质的成纤维细胞和前庭膜，而毛细胞和螺旋神经元细胞的感染率很低。耳蜗各部位细胞的感染率均随着病毒滴度浓度的增加而相应增长，但是高浓度滴度的腺病毒感染可以造成耳蜗组织细胞结构的破坏。在腺病毒感染后不同的时间固定耳蜗，发现最早出现绿色荧光蛋白的细胞是耳蜗间质组织的成纤维细胞。耳蜗支持细胞被感染后，绿色荧光蛋白的表达随着培养时间的延长而逐渐增强。同时我们还发现如果应用低浓度的细胞消化酶处理样品，可以增加腺病毒对毛细胞的感染效率。还有，与正常耳蜗的转染相比，在应用AdV/EGFP感染庆大霉素损伤后的耳蜗组织中发现Deiter’s细胞的感染率明显增加，说明耳蜗毛细胞损害后腺病毒更加容易穿越屏障，从而感染较深部的耳蜗支持细胞。 三、神经营养因子是目前临床用于维持神经元存活和生长的重要因子。由于NTs难以通过耳蜗血迷路屏障，我们采用重组腺病毒介导BDNF和NT3转染体外培养的耳蜗组织，以观察BDNF和NT3对SGNs延迟性死亡的保护。首先用AdV/EGFP-BDNF，AdV/EGFP-NT3和 AdV/EGFP-BDNF，<WP=111>AdV/eGFP-NT3重组病毒感染耳蜗组织3小时，然后应用庆大霉素破坏全耳蜗毛细胞并进行体外培养，7天后固定，将培养组织固定并进行Neurofilament 200kD免疫荧光染色。荧光显微镜下观察，发现不经NTs处理的耳蜗组织中仅有14%的SGNs存活，但是在AdV/EGFP-NT3转染组和AdV/EGFP-BDNF转染组，耳蜗SGNs的存活数目分别为51％和39％，均明显高于庆大霉素组。 然而，在AdV/EGFP-BDNF联合AdV/EGFP-NT3感染组，耳蜗SGNs的存活数目竟然高达69%，显著高于BDNF或NT3的单独应用，说明二者通过结合不同的受体途径维持SGNs存活。 四、庆大霉素破坏毛细胞之后导致的神经元退化机制可能有两种不同的途径，其一是神经元凋亡，另一条途径是神经元坏死。在许多神经元损害的过程中都伴随着细胞内钙离子增高的过程，细胞内的高钙浓度可以对细胞造成许多损害。Calpain是一类钙激活的蛋白酶，细胞内钙离子浓度的增高可以引起Calpain过度活动而导致细胞骨架、膜蛋白、各种激酶以及转录因子崩溃，Calpain 的激活往往是神经变性坏死的早期信号。Calpastatin是Caplain的内源性抑制剂，具有调节和抑制Calpain活动的功能。我们用腺病毒介导的calpastatin转染耳蜗培养组织，观察calpastatin对神经元延迟性死亡的抑制作用及其与神经营养因子联合应用的神经保护。结果发现，AdV/Calpastatin感染组中耳蜗SGNs的存活数目高于单纯庆大霉素作用组。另外，AdV/Calpastatin 与AdV/EGFP-BDNF的联合应用或者AdV/Calpastatin 与AdV/EGFP-NT3的联合应用与AdV/Calpastatin单独使用相比，SGNs的存活比率得到更显著的提高，说明可能存在不同的SGNs死亡和保护机制。 综上所述，毛细胞是耳蜗中产生NTs的主要来源，一旦全部毛细胞坏死，SGCs将由于缺乏NTs而产生延迟性死亡。本研究将腺病毒介导的外源基因转染到耳蜗支持细胞，意在使感染的耳蜗支持细胞代替先前的毛细胞产生分泌NTs以维持SGNs的存活。同时，由于Calpain在延迟性神经元死亡过程<WP=112>中也充当了杀手角色，因此，Calpain抑制剂的应