论文部分内容阅读
研究背景与研究目的:胃癌（Gastric cancer,GC）是全球第四大致死性恶性肿瘤,死亡率占所有癌症死亡率的7.7%,仅次于肺癌、结直肠癌和肝癌。由于胃癌早期缺乏特殊的症状及体征,常隐匿发病,因此早期胃癌诊断率特别低,而晚期胃癌往往因为错过最佳手术时机,治疗手段有限。因此,寻找能够用于胃癌早期检测、靶向治疗乃至预测预后的新型生物标志物十分迫切。有研究表明SKAP1在数种肿瘤中表达上调,包括结肠癌、恶性蕈样肉芽肿和乳腺癌等,具有促增殖侵袭的作用且与肿瘤不良预后相关。但SKAP1在胃癌中的作用及具体机制尚不明确。本研究旨在探究SKAP1在胃癌组织及其相邻正常组织中的表达情况,分析SKAP1的表达与胃癌病人临床病理参数之间的关系及其预后价值,并进一步探讨SKAP1在胃癌细胞中的表达情况以及在细胞增殖、迁移和侵袭等胃癌发展进程中的潜在功能与分子机制。材料方法:（一）SKAP1在胃癌中的表达、预后及生物信息学分析1、SKAP1在胃癌组织中表达分析:（1）通过TIMER数据库分析SKAP1在各种肿瘤组织及其对应正常组织的表达情况,利用TCGA数据库及GEO数据库中胃癌测序数据分析SKAP1在胃癌组织及正常胃上皮组织中的表达差异。（2）从医院收集21对胃癌及癌旁组织,实时荧光定量PCR（q RT-PCR）和Western Blot检测SKAP1在胃癌及对应癌旁组织中的表达。2、SKAP1与胃癌患者临床病理参数及预后的关系:（1）利用TCGA数据库中胃癌数据,分析SKAP1的表达与胃癌患者临床病理参数的相关性。（2）通过Kaplan-Meier Plotter网站,分析SKAP1高表达与胃癌患者的总生存期（overall survival,OS）,进展后生存期（post progression survival,PPS）,以及无进展生存期（progression free survival,PFS）的关系。3、生物信息学预测SKAP1调控胃癌进展的可能机制:以SKAP1表达值的中位数为界,将其分为SKAP1高表达组和SKAP1低表达组,然后将整理后的两组数据进行GSEA富集分析,进一步预测SKAP1调控胃癌进展的分子机制。（二）SKAP1通过JAK1/PI3K/AKT信号轴调控胃癌细胞生物学行为1、SKAP1对胃癌细胞生物学行为的影响:（1）使用si RNA-SKAP1转染胃癌细胞MKN45和HGC27,Western Blot和q RT-PCR检测沉默效率;（2）使用MTS、Ed U实验和克隆形成实验检测沉默SKAP1后细胞增殖能力的变化;（3）通过Transwell侵袭迁移实验分析沉默SKAP1后胃癌细胞侵袭迁移能力的变化;（4）通过流式细胞术检测SKAP1表达变化与细胞凋亡的关系。2、SKAP1对胃癌细胞JAK1/PI3K/AKT信号轴的调控作用:（1）q RT-PCR检测沉默SKAP1后高表达SKAP1组富集出的通路关键基因m RNA水平的变化;（2）Western Blot检测沉默SKAP1后胃癌细胞JAK1、PI3K、AKT及其磷酸化蛋白的表达水平。3、PI3K激动剂对SKAP1调控胃癌细胞生物学行为的影响:在沉默SKAP1的基础上,（1）通过Western Blot检测应用PI3K激动剂740 Y-P后,JAK1、PI3K、AKT及其磷酸化蛋白的表达水平变化;（2）通过MTS、Ed U实验和克隆形成实验检测应用PI3K激动剂740 Y-P后细胞增殖能力的改变;（3）通过Transwell侵袭迁移实验分析应用PI3K激动剂740 Y-P后胃癌细胞侵袭迁移能力的变化。结果:（一）SKAP1在胃癌中的表达、预后及生物信息学分析1、SKAP1在胃癌组织中高表达:（1）SKAP1在多种肿瘤中表现出高表达趋势,尤其是胃肠道肿瘤（食管癌、胃癌、结肠癌和直肠癌）。分析TCGA及GEO胃癌数据发现SKAP1在胃癌组织中的表达明显高于癌旁组织。（2）共收集21例胃癌及癌旁组织标本,q RT-PCR及WB结果均显示SKAP1在癌组织中的表达显著高于对应癌旁组织。2、SKAP1与胃癌患者临床病理参数及预后的关系:（1）SKAP1高表达与胃癌患者T分期及Grade分级显著相关（P＜0.05）。（2）Kaplan-Meier Plotter数据库分析显示SKAP1高表达胃癌患者的OS、PPS以及PFS均显著短于SKAP1低表达的胃癌患者,高表达SKAP1是胃癌患者不良预后因素之一。3、生物信息学预测SKAP1调控胃癌进展的可能机制:GSEA富集分析结果显示,JAK-STAT通路、PI3K-AKT通路、TNF-α通路在SKAP1高表达组显著富集。另外,SKAP1高表达与增殖相关生物过程（如MYC Targets、E2F Targets、G2M细胞周期检查点、纺锤体形成,DNA修复等）和炎症反应相关。（二）SKAP1通过JAK1/PI3K/AKT信号轴调控胃癌细胞生物学行为1、沉默SKAP1对胃癌细胞生物学行为的影响:（1）WB及q RT-PCR检测结果表明si RNA-SKAP1的应用显著降低了SKAP1在两种胃癌细胞中的表达。（2）MTS、Ed U实验和克隆形成实验结果表明沉默SKAP1后细胞增殖能力下降。（3）Transwell侵袭迁移实验显示沉默SKAP1后胃癌细胞侵袭迁移能力下降。（4）流式细胞仪检测细胞凋亡发现沉默SKAP1对于胃癌细胞凋亡未显示出显著影响。2、SKAP1调控胃癌细胞中JAK1/PI3K/AKT信号轴:（1）q RT-PCR结果显示沉默SKAP1后JAK1的m RNA水平显著下降。（2）WB结果显示沉默SKAP1后JAK1、P-JAK1、P-PI3K、P-AKT蛋白减少。3、PI3K激动剂对SKAP1调控胃癌细胞生物学行为的影响:（1）WB显示与SKAP1沉默组相比,应用PI3K激动剂740 Y-P后,JAK1、P-JAK1、PI3K、AKT蛋白水平不变,P-PI3K和P-AKT增加。（2）MTS、Ed U实验、克隆形成实验显示,与SKAP1沉默组相比,加入PI3K激动剂740 Y-P后细胞增殖能力显著提升。（3）Transwell侵袭迁移实验发现与SKAP1沉默组相比,应用PI3K激动剂740 Y-P后胃癌细胞侵袭迁移能力显著提高。结论:1、SKAP1在胃癌组织中高表达并与胃癌患者预后不良相关。2、SKAP1高表达促进MKN45及HGC27胃癌细胞增殖、侵袭和迁移,与细胞凋亡相关性不显著。3、SKAP1可能通过激活JAK1/PI3K/AKT信号轴促进胃癌细胞增殖、侵袭、迁移等生物学功能,促进胃癌进展。