PTEN(phosphatase with tensin homology deleted on chromosome 10)基因最早是在1997年由3个研究小组先后克隆并命名,是作为肿瘤的抑制基因被发现的。PTEN基因已成为近年的研究热点,有专家认为其生物学意义的重要性可与P53相比。研究发现在多种肿瘤中存在PTEN基因的改变。本研究发现特异性敲除腺胃上皮PTEN基因的小鼠胃癌发生率为100%,加之以前的临床研究表明在胃癌中PTEN的表达显著降低,而且PTEN表达的下降与胃癌的转移和预后密切相关,这就更说明PTEN基因与胃癌发生之间有很紧密的联系。关于PTEN敲除导致小鼠发生胃癌的研究国内外尚未见报道。胃癌病因及发病机制十分复杂,至今尚未完全阐明。通过各种研究技术和手段深入研究胃癌发生、发展、转移以及耐药的分子机制,寻找早期诊断的分子标记物以及药物靶标已成为目前研究的热点。为了深入考察PTEN在胃癌发生中的功能,本研究利用基于Cre-LoxP系统的条件基因敲除技术在小鼠腺胃上皮细胞中特异性地敲除PTEN基因,通过对这些组织特异性PTEN基因敲除小鼠的表型进行系统的分析,获得靶标明确、表型稳定、遗传背景清晰、与人类胃癌发生发展过程相似的胃癌小鼠模型。本研究以胃癌模型小鼠为实验组,以没有敲除PTEN的小鼠为对照组,应用蛋白质组学技术手段建立差异表达图谱并进行差异蛋白的鉴定,为深入研究PTEN调节信号通路及相关蛋白在小鼠胃癌发生中的作用及可能机制和筛选胃癌的早期诊断标记物和治疗靶标奠定基础。本研究应用基于双向凝胶电泳分离结合质谱鉴定的经典蛋白质组策略对特异性地敲除PTEN基因的小鼠腺胃上皮组织进行分析。首先,应用双向凝胶电泳(2-DE)对不同月龄的野生型与PTEN敲除型小鼠腺胃上皮组织样品进行分离,以同龄野生型小鼠的腺胃上皮组织为对照建立差异表达图谱,通过凝胶成像分析和人工比对,分别确定差异蛋白质斑点。然后对每个差异蛋白点进行胶内酶切,最后通过基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱的肽质量指纹图技术和电喷雾电离串联质谱技术的肽序列标签信息结合数据库检索鉴定蛋白质。鉴定差异蛋白后,通过检索PUBMED文献或SWISSPROT等数据库,对差异蛋白的生物学功能进行了较为详细的了解和分类,为进一步深入研究这些差异蛋白的功能和其在PTEN参与的信号通路中的作用打下了一定的基础。同时对差异的蛋白质进行转录水平及蛋白水平验证,在其中发现可作为胃癌的早期诊断标记物和治疗靶标的蛋白质.同时对感兴趣的差异的蛋白质在细胞模型中研究其在PTEN参与的信号通路中的具体作用.组织学分析表明PTEN敲除小鼠在出生后30天(一月龄)起逐步出现腺胃上皮的过度增生、不典型增生、以及粘膜内的原位癌。PTEN敲除小鼠在出生后的40-60天左右死亡,体重明显减轻;尸检可见小鼠腺胃明显增厚、变硬、胃壁皱褶消失。为系统研究PTEN敲除在胃癌发生发展中的蛋白质组的变化,我们应用2-DE对一月及二月龄的野生型与各自PTEN敲除型小鼠腺胃上皮组织样品进行分离和对比,建立差异表达图谱,通过凝胶成像分析和人工比对,分别确定差异蛋白质斑点78个和83个。这些点分布在PI5-8、分子量8-170KD的范围内,最大表达上调8.6倍,下调最低至0.1倍。经胶内酶切和质谱鉴定,共鉴定一月龄差异蛋白质点65个,35个下调,对应31种蛋白质,30个蛋白质点上调,对应26种蛋白质,其中有1个蛋白存在3个异构体。二月龄差异蛋白质斑点57个,21个下调点对应20个蛋白质,36个上调点对应33个蛋白质,其中有4个蛋白存在2个异构体。一月龄差异蛋白质与二月龄的相比较,10个变化趋势和蛋白均相同,其中上调的有5个,下调5个。这些差异蛋白质中24个报道与胃癌相关,其中一月龄中29%与信号传导相关,二月龄中32%与信号传导相关。一月龄差异蛋白质的功能分类如下:与细胞代谢相关的28个,与细胞结构蛋白相关的14个,与蛋白降解系统相关的2个,与信号传导相关的19个,与转录和翻译相关的2个,二月龄差异蛋白质的功能分类如下:与细胞代谢相关的25个,与细胞结构蛋白相关的3个,与蛋白讲解系统相关的5个,与信号传导相关的18个,与转录和翻译相关的5个。在这些蛋白质中,有些与PTEN信号转导通路有关,如膜联蛋白A3,膜联蛋白A2,磷脂酰肌醇转移蛋白α等。其中二月龄上调蛋白膜联蛋白A2(Annexin 2),可以与PtdIns(4,5)P2结合,招募它到指定位置,而PtdIns(4,5)P2在PTEN影响的细胞分化中发挥重要作用,提示其可能在PTEN缺失与胃癌形成之间发挥某种作用.有些蛋白与肿瘤发生,迁移相关,比如Ezrin,抑制素等,其中抑制素已有报道在乳腺癌,胃癌等肿瘤发生中发挥作用,且已成为研究的重要蛋白。这些蛋白为研究PTEN参与的信号通路及其在胃癌发生中的作用提供了重要线索,对差异的蛋白质进行转录水平及蛋白水平验证以及在细胞模型中研究其在PTEN参与的信号通路中的具体作用还要进一步的研究。本研究在组织特异性PTEN基因敲除小鼠发生胃癌的基础上,应用蛋白质组学技术鉴定了不同肿瘤发生阶段相关的共100多个蛋白质,为深入研究受PTEN调节信号通路在小鼠胃癌发生中的作用及其可能机制,以及为筛选胃癌的早期诊断标记物和治疗靶标奠定了一定的基础。