论文部分内容阅读
本研究旨在检测CSN2质粒两端的调控序列对β-酪蛋白基因表达效率的影响,并对其进行基因敲除操作,构建缺失β-.酪蛋白基因CDS区的CSN2质粒,从而为利用该质粒两端的调控序列,研究新插入基因的表达奠定基础。
首先,进行了小鼠乳腺细胞的原代培养,并对其进行脂质体介导的CSN2质粒转染,然后通过收集细胞进行RT-PCR,检测β-酪蛋白基因在乳腺组织的表达。采用CSN2质粒作为基因打靶的载体,设计不同的引物,PCR扩增同源臂,然后和筛选基因(Neo基因)连接,利用Red同源重组系统与CSN2质粒进行同源重组,最后又利用抗性基因两端的loxP位点,诱导Cre酶表达,对重组阳性质粒进行了筛选基因的敲除。结果表明:所培养的原代小鼠乳腺上皮细胞的培养,具有上皮细胞特征。用CSN2质粒转染小鼠乳腺上皮细胞,可检测到β-酪蛋白基因的高效表达。利用同源重组技术成功地敲除了β-酪蛋白基因的编码区,获得了缺失β-酪蛋白基因CDS区的CSN2质粒。在实验中还发现敲除1kb和6kb的DNA片断效率相似,而敲除100bp以内的DNA片断效率较低。