背景与目的：甲状腺癌是内分泌系统和头颈部肿瘤中最常见的恶性肿瘤。每年甲状腺癌新发病例占所有癌症发病的1%-5%,女性发病高于男性,甲状腺癌的发病率随年龄的增长而上升。近年来,甲状腺癌发病率持续快速增长,引起了广泛关注。甲状腺癌根据其病理特点分为乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)、滤泡状癌(follicular thyroid carcinoma, FTC)、髓样癌(medullary thyroid carcinoma, MTC),未分化癌(anaplastic thyroid cancer,ATC)等,其中PTC与FTC为分化型甲状腺癌(differentiated thyroid cancer,DTC),预后良好。ATC虽然少见,但恶性程度高,预后极差。甲状腺癌通常对化疗药物无反应,目前DTC的治疗方法主要是外科手术、术后放射性碘治疗和促甲状腺激素抑制治疗。大多数PTC和FTC分化程度较高,对以上治疗策略反应良好。但其中仍有一部分患者进展为PDTC (poorly differentiated thyroid cancer),其肿瘤组织分化程度较差,生物特性倾向于ATC,侵袭程度高,对目前常规的甲状腺癌治疗策略反应欠佳,如病灶不能摄取碘,缺乏其它有效的治疗方法,导致疾病复发甚至死亡；PDTC和ATC预后不良。因此,积极寻求PDTC和ATC的治疗新策略对提高甲状腺癌的疗效、改善患者的生存率、丰富治疗方案和个性化治疗具有重要性和迫切性。维甲酸是维生素A的中间代谢产物。维生素A(视黄醇,retinol)进入细胞后,经过氧化反应转化为视黄醛,视黄醛被氧化变成维甲酸。维甲酸存在不同亚型,包括全反式维甲酸(all trans retinoic acid, RA),9-顺式维甲酸(9-cis retinoic acid, 9-cis RA)和13-顺式维甲酸(13-cis retinoic acid,13-cis RA)等,其中RA是临床上已经使用的促分化治疗的抗肿瘤药物。RA对肿瘤的生物学作用主要是诱导肿瘤细胞分化和凋亡,增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,并可以促进免疫细胞的增殖。RA联合三氧化二砷在治疗急性早幼粒性白血病(acute promyelocytic leukemia, APL)取得超过80%的缓解率,已经成为APL治疗的首先方案。因此,国内外持续开展对RA治疗其它恶性肿瘤的实验研究。例如,RA可提高部分甲状腺癌的摄碘率；RA可以诱导舌鳞状细胞癌的细胞分化；对宫颈癌,皮肤癌和肾细胞癌也有治疗效果。但是,已经发现肿瘤细胞对RA信号的敏感性存在差异。即使是同一肿瘤不同亚型的细胞对维甲酸的敏感性也不尽相同。例如,我们实验室发现：部分髓母细胞瘤细胞系在维甲酸处理时出现细胞增殖抑制和分化诱导作用,但是其它髓母细胞瘤细胞系对RA信号无反应,即对RA耐药,其分子机制尚未完全阐明。RA具有脂溶性,使其可以直接透过细胞膜进入胞浆。随着最近对RA信号通路认识的不断深入,发现存在两条RA信号转导通路,分别由细胞内两种不同的结合蛋白维甲酸结合蛋白2(cellular retinoic acid-binding pretein Ⅱ, CRABP-Ⅱ)和脂肪酸结合蛋白5(Fatty acid-binding protein 5, FABP5)介导,分别转运RA到核受体RAR和PPARβ/δ。RA信号通过载体进入细胞核后,可以通过核受体的转录调控活性,调节基因的表达。据我们所知,到目前为止,虽然已经在一些肿瘤中已经有这方面的报道,但是还没有关于甲状腺癌中的RA-CRABP-Ⅱ-RAR与RA-FABP5-PPARβ/δ两条信号通路状态的报道。由于肿瘤细胞的发生发展是多因素的。通常,单一用药几乎无法满足临床治疗的需求。所以寻找有效的药物和合理的配伍用药方案,既可以增加肿瘤细胞的药物敏感性,减少肿瘤对药物的耐受能力,同时可降低单一用药产生的药物毒副作用。近年,由于人们已经意识到表观遗传学是肿瘤形成和发展过程中的一个关键因素,所以影响表观遗传修饰的药物在基础研究和临床化疗过程中扮演了越来越重要的角色。表观遗传修饰的机制有多种,其中DNA甲基化是最重要,也是研究最广泛的表观修饰方式。许多报道证实：去甲基化药物的作用可以逆转肿瘤细胞的表观遗传调控失调,并改善肿瘤细胞的化学药物敏感性。我们实验室发现：去甲基化作用可以逆转部分髓母细胞瘤细胞系细胞的CRABP-Ⅱ沉默及对RA的敏感性。甲状腺癌与其它恶性肿瘤一样,存在迷乱的基因甲基化；地西他滨(dicitabine,DAC)作为胞嘧啶类似物,是已经被FDA批准用于临床治疗骨髓增生异常综合征的一种去甲基化药物。为此,本文以未分化甲状腺癌KAT-18细胞系及PDTC或ATC组织为研究对象,以对RA相对敏感的髓母细胞瘤细胞系MED3细胞作为对照；观察RA在未分化甲状腺癌中的敏感性以及PDTC或ATC组织中维甲酸胞内结合蛋白的表达情况；并利用分子生物学检测方法分析维甲酸信号通路组分的表达与其敏感性的关系；应用去甲基化药物DAC联合RA,观察在改变肿瘤细胞的表观遗传修饰后,是否可以改变肿瘤维甲酸信号通路状态及RA信号的敏感性,进一步探讨肿瘤细胞RA信号的分子机制。材料与方法：实验所用的人未分化甲状腺癌细胞系KAT-18由美国肯塔基大学医疗中心内分泌分子医学中心甲状腺癌研究实验室Kenneth B. Ain, M.D.教授建立提供。人髓母细胞瘤细胞系Med-3为一名10岁男性髓母细胞瘤患者的手术切除标本,由日本神户大学神经外科建立提供。29例PDTC或ATC组织标本由大连医科大学附属第一医院病理科及中国医科大学病理科提供。取20例瘤旁组织作为正常对照。本研究采用组织微阵列、细胞培养、HE染色、Hoechst活细胞染色、免疫组织化学(IHC)、免疫细胞化学(ICC)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、蛋白免疫印迹(Western-blotting)等方法,开展了以下内容：1)采用了HE染色,MTT检测和Hoechst活细胞染色等技术观察人未分化甲状腺癌细胞系KAT-18与人髓母细胞瘤细胞系Med-3的维甲酸敏感性；2)观察维甲酸信号通路组分：维甲酸胞内载体CRABP-Ⅱ和FABP5,核内受体RARa, PPARβ/δ等在人未分化甲状腺癌KAT-18细胞系的表达情况,以及RA对各组分转录水平的影响；3)采用蛋白免疫印迹和免疫细胞化学检测KAT-18细胞中维甲酸胞内结合蛋白CRABP-Ⅱ、 FABP5,核受体RARa和PPARβ/δ等的表达情况；4)镜下观察、HE染色和MTT检测等筛选去甲基化剂DAC的合理用药浓度；5)通过HE染色,MTT检测和Hoechst活细胞染色技术检测联合用药后,观察KAT-18细胞系RA敏感性的变化；6)逆转录聚合酶链式反应检测胞内结合蛋白CRABP-Ⅱ、FABP5和核受体RARα、PPARβ/δ等表达情况；7)通过人甲状腺癌组织微阵列结合免疫组织化学技术检测CRABP-Ⅱ和FABP5表达情况。实验数据采用Prism 5.0(GraphPad Software,Inc.,La Jolla,CA)统计软件进行统计分析。结果：一、低分化、未分化甲状腺癌组织中维甲酸信号通路状态的研究在本组29例人低分化、未分化甲状腺癌组织微阵列中,所有标本失去正常的结构,呈低分化或未分化表现。1.1维甲酸信号通路关键组分FABP5.CRABP-Ⅱ的表达依据相对表达情况分为四种类型：FABP5(++)/CRABP-Ⅱ(+/-)表达类型；FABP5(+)/CRABP-Ⅱ(+)均衡表达类型；CRABP-Ⅱ(-)/FABP5(-)表达类型；CRABP-Ⅱ(+)/FABP5(-)表达类型。1.2低分化或未分化甲状腺癌组织中FABP5/CRABP-Ⅱ的表达比率类型在本组病例中,FABP5(++)/CRABP-Ⅱ(+/-)表达比率类型37.9%(11/29)；FABP5(+)/CRABP-Ⅱ(+)均衡表达类型41.4%(12/29);FABP5(-)/CRABP-Ⅱ(-)均阴性表达类型6.9%(2/29)；CRABP-Ⅱ(+)/FABP5(-)表达类型13.8%(4/29)。在本组PDTC或ATC标本中,FABP5的表达阳性率为79.3%,明显高于癌旁正常甲状腺组织中的阳性率40.0%；CRABP-Ⅱ表达的阳性率为65.5%,明显高于癌旁正常甲状腺组织中的阳性率25.0%。CRABP-Ⅱ和FABP5在PDTC或ATC中的表达相关性无统计学意义。二、未分化甲状腺癌细胞系维甲酸敏感性与维甲酸信号通路状态关系的研究2.1维甲酸处理后未分化甲状腺癌KAT-18细胞的形态学观察HE染色结果显示：在10μM RA,48h处理条件下,KAT-18细胞形态及细胞数未见明显差异,提示KAT-18细胞对RA不敏感。2.2 MTT实验结果及维甲酸信号通路成员mRNA水平表达情况KAT-18细胞分别在1.5.10μM RA,48h处理条件下,MTT分析未见明显差异,提示KAT-18细胞对RA不敏感,与HE染色结果相符合。在10μM RA,48h处理条件下,KAT-18细胞的CRABP-Ⅱ、FABP5、RARα和PPARDβ/δ的mRNA表达情况：FABP5表达强于CRABP-Ⅱ表达；RA处理前后各组分的mRNA水平表达几乎没有变化。KAT-18细胞与MED-3细胞在10μM RA,48h处理条件下,KAT-18细胞RA处理组与对照组MTT分析未见差异；对RA不敏感KAT-18细胞呈FABP5(++)/ CRABP-Ⅱ (+/-)表达类型。MED-3细胞RA处理组与对照组MTT分析差异有显著性(*,P<0.05)；对RA敏感的MED-3细胞呈CRABP-Ⅱ (+)/FABP5(-)表达类型。2.3维甲酸信号通路组分蛋白水平表达情况在10μM RA,48h处理条件下,ICC检测维甲酸通路组分表达情况：KAT-18细胞的FABP5表达几乎没有变化；但RA处理后CRABP-Ⅱ表达略有增强。Western-blotting检测KAT-18细胞的CRABP-Ⅱ FABP5、RARα和PPARβ/δ蛋白表达情况：RA处理前后维甲酸信号通路组分CRABP-Ⅱ和FABP5的表达情况与ICC检测结果大致相同；RARα、PPAR(3/8表达几乎没有变化。2.4甲状腺癌分化标志物表达情况在10μM RA,48h处理条件下,KAT-18细胞中,对照组与RA处理组均可见NIS微弱表达；对照组可见Tg微弱表达,RA处理组Tg表达似乎略增强；正常甲状腺组织中可见Tg与NIS强表达。三、地西他滨联合维甲酸对未分化甲状腺癌细胞系维甲酸敏感性的影响及其与维甲酸信号通路状态关系的研究3.1 DAC联合RA处理未分化甲状腺癌KAT-18细胞的形态学观察HE染色结果：在25μM DAC,72h处理条件下,KAT-18细胞形态轻微增大,细胞明显减少；但在10μM RA,48h或10μM DAC,72h+10μM RA,48h处理条件下,KAT-18细胞形态及细胞数未见明显差异。3.2 Hoechst活细胞染色结果Hoechst活细胞染色：在DAC或DAC联合RA处理KAT-18细胞后,KAT-18细胞分别在10μM RA,48h; 5,10,25μM DAC,72h; 5,10,25μM DC A,72h+10μM RA,48h处理条件下,DAC联合RA组的每个视野细胞数略多于同剂量DAC组；DAC组(5,10,25μM,72h)的细胞数少于对照组(与对照组比较,*,P<0.05)。3.3维甲酸信号通路组分mRNA水平表达情况RT-PCR结果：KAT-18细胞在5,10μM DAC,72h或DAC联合RA(10μM DAC, 72h+10μM RA,48h)或10μM RA,48h处理条件下,对照组和RA组的CRABP-Ⅱ FABP5在mRNA水平表达几乎无变化；这提示DAC或DAC联合RA处理没有改变KAT-18细胞的FABP5/CRABP-Ⅱ的表达比率。与FABP5表达比较,KAT-18细胞CRABP-Ⅱ的表达相对较低。结论：1.在本组PDTC或ATC标本中,FABP5的表达阳性率为79.3%,明显高于正常甲状腺组织中的阳性率40.0%；CRABP-Ⅱ表达的阳性率为65.5%,明显高于正常甲状腺组织中的阳性率25.0%。但CRABP-Ⅱ和FABP5在PDTC或ATC中表达相关性无统计学意义。2.未分化甲状腺癌细胞系KAT-18对RA不敏感。未分化甲状腺癌细胞系KAT-18的维甲酸信号通路中,维甲酸载体呈FABP5 (++)/CRABP-Ⅱ (+/-)表达类型。3.RA没有改变未分化甲状腺癌细胞系KAT-18维甲酸信号通路组分的表达及表达类型。RA也没有改变未分化甲状腺癌细胞系KAT-18的Tg、NIS低或未表达状态。4.去甲基化药物DAC可以抑制未分化甲状腺癌细胞KAT-18的生长。DAC或DAC联合RA不能改变未分化甲状腺癌细胞系KAT-18对RA敏感性；也不能改变未分化甲状腺癌细胞系KAT-18的维甲酸信号通路中的关键组分FABP5/ CRABP-Ⅱ的表达比率。5.DAC联合RA序贯处理未分化甲状腺癌细胞系KAT-18时,联合RA组的效果不及同剂量的DAC组,提示在DAC联合应用RA处理未分化甲状腺癌策略中,RA可能具有促进KAT-18细胞生长的作用。因此,在甲状腺癌的治疗策略中,如果涉及RA时,应该考虑到维甲酸RA-FABP5-PPAR β/δ增殖信号通路情况。