双生病毒卫星DNA编码的βC1基因的原核表达、单克隆抗体制备及细胞定位

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双生病毒是一种呈孪生颗粒形态的植物单链环状DNA病毒,至今已在多个国家和地区的多种作物上造成毁灭性危害。近年来发现一些单组分双生病毒伴随有卫星DNAβ。迄今发现的所有DNAβ分子在互补链上都含有一个位置和大小保守的βC1基因,该基因是一个参与症状诱导的关键因子。本论文进行了βC1基因的原核表达,并制备了单克隆抗体。利用原核表达载体pET-30a和pET-32a在大肠杆菌中分别表达了与中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus)Y10分离物(TYLCCNV-Y10)和烟草曲茎病毒(Tobacco curly shoot virus)Y35分离物(TbCSV-Y35)相伴随的DNAβ分子的βC1基因,用Ni2+-NTA树脂亲和纯化了重组蛋白Y10βC1和Y35βC1。分别以重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,用杂交瘤细胞技术制备了6株能够稳定传代并分泌抗Y10βC1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,各单抗腹水的间接ELISA效价在1:16000~1:128000之间,获得9株分泌抗Y35βC1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,各单抗腹水的间接ELISA效价在1:128000~1:1024000之间。用制备的Y10βC1和Y35βC1单克隆抗体分别对TYLCCNV-Y10和TbCSV-Y35侵染的烟草中的βC1蛋白进行亚细胞定位,结果发现该蛋白在健康烟草中没有积累,而在病毒侵染的烟草细胞核和叶绿体中表达并积累。
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