研究背景神经系统的发育是通过受基因调控的神经发生、细胞分化及迁徙等多个复杂过程而实现的并受母孕期环境因素的影响,相关基因的功能异常或者母亲孕期高危因素的存在可导致胎儿神经系统发育异常,包括胎儿或者新生儿神经系统形态或者结构的异常,如脑积水、神经管畸形等,以及出生后需要进一步的生化或者功能检查才能确定是否存在功能发育异常,如智力障碍、脑瘫等,这些神经系统结构以及功能发育异常是最严重的先天性出生缺陷,目前的预防和治疗手段远未达到临床实际需求。我国每年约2000万新生儿出生,其中先天发育异常儿有60万左右。在发育异常的新生儿中,神经管缺陷是较为常见的形态和结构异常,我国每年有2亿元用于这些患儿的救治。功能异常的神经发育不良患儿数量远高于神经系统形态和结构的发育异常,由于不易早期识别,潜在危害以及经济负担更加严重。自吞噬在脑的正常发育过程中起重要的作用,大量的新生细胞因未建立起功能连接而以自吞噬或者凋亡的方式被清除,以保持大脑的形态结构正常发育。自吞噬在损伤因素的作用下被广泛激活,以清除大量坏死细胞,减少炎症反应,但是过度的自吞噬可以导致胞浆及细胞器的结构和功能破坏,导致细胞死亡,因此自吞噬具有维持细胞存活和导致细胞死亡的双重作用。自噬相关基因5和自噬相关基因7(ATG5和ATG7)是参与自噬体形成的重要成员,可能进一步影响相关基因的功能表达,但是有关于atg5和atg7基因的多态性与脑性瘫痪的关系尚未见报道。脑瘫是目前导致我国儿童致残的首位原因,全国现有200万以上脑瘫患儿需要康复治疗,其中有31万例学龄前脑瘫患儿,并以每年4.6万的速度递增,严重影响了我国人口素质的提高。但是脑瘫的发病病因及发病机制目前尚不明确,越来越多的证据显示遗传因素在脑瘫的发生发展过程中起重要作用。本研究首先通过临床患儿的流行病学研究调查围产儿神经发育现况的动态变化以及影响的因素,而后以导致儿童伤残首位原因的脑瘫为研究对象进行临床大样本的实验分析,探讨自噬相关基因在脑瘫患儿发生发展中的作用,为围产儿神经发育异常和脑瘫的防治提供理论基础。第一部分以人群为基础围产儿神经发育现状的流行病学研究第一节先天发育异常流行病学资料分析目的通过整理收集河南省监测医院及监测点内住院分娩的所有妊娠满28周至产后7天内围生儿中的先天发育异常儿,尤其是神经管缺陷的发生情况,进一步分析常见先天发育异常的发生率、分布地区和人群分布等,制定相应的预防措施提供依据。方法本实验的数据包括河南省从1997年1月1日到2011年12月31日所有监测医院及监测点内先天发育异常儿的信息,均经体格检查和其他辅助检查如超声、x射线、核磁共振、染色体分析或尸检等来证实诊断,确诊后填写《出生缺陷登记卡》,内容包括孕龄、性别、母亲年龄、居住地、主要诊断及新生儿转归等。所有信息输入excel2010表格,转录入spss17.0软件进行统计分析,发生率(%)采用卡方检验,发生率的趋势采用逻辑回归分析,以p<0.05为差异有统计学意义的检验水准。结果1.先天发育异常总发生率15年间,我省检测点共收集1 815 920名新生儿,有15 660名围产儿存在先天发育异常,平均发生率为86.24/万。监测期间农村平均发生率高于城市(χ2=4.023,P=0.045)。Logistic回归分析显示,农村发生率呈显著下降趋势(P<0.0001),城市发生率呈增长趋势,且有统计学意义(P=0.003)。总的平均发生率呈稳步下降状态,从1997年的109.8/万到2003年的82.3/万(χ2=49.06,P<0.001),然后保持相对稳定到2011年80.19/万(χ2=185.29,P<0.0001)。15年间农村发生率下降55.2%,城市发生率上升19.3%。导致整体发生率下降26.9%。2.亚组分析显示:(1)男孩平均发生率为86.43/万和女孩为83.54/万(χ2=4.44,P=0.035),男孩略高于女孩。所有监测的人群中,母孕期不同年龄组中,平均发生率最低的78.2/万为25到29岁间的组别,最高的为小于20岁组别,发生率为122.003(χ2=37.545,P<0.001);(2)15年间,2007年以前神经管缺陷的排名一直位居第一位,2009年以后位居第三位。其1997年发生率为39.3/万,到2011年下降到6.1/万(χ2=388.853,P<0.001),下降率达到84.5%。结论1.15年间,我省先天发育异常发生率呈稳步下降状态。农村显著下降,城市呈增长趋势。2.男性发生率略高于女性。平均发生率最低母孕期年龄为25到29岁间,最高为小于20岁组别;3.神经管缺陷发生率呈明显下降趋势。第二节围产儿不良神经预后的分析目的采用围产期出生新生儿及住院患儿资料统计分析,并对诊断为新生儿脑损伤的患儿通过随访,研究分析其远期不良神经预后。方法选择从2007年1月至2012年12月由我院接诊分娩和分娩后住院围产儿为研究对象。所有数据分层按性别、出生体重、分娩方式、产妇年龄、孕龄,单胎或多胎,妊娠期并发症(妊娠期糖尿病,妊高症,胎膜早破等)等进行记录。所有围产期新生儿及患儿发病率均以年为计算单位,对脑损伤患儿在其年龄≥1岁后进行随访(住院病例+电话随访+来院复诊)工作。所有数据应用SPSS17.0统计软件进行分析。计数资料以百分率(%)表示,采用χ2检验比较,多因素采用Logistic回归分析,统计OR值及95%可信区间,均以P<0.05差异有统计学意义的检验水准。结果1.总体分析:6年间我院分娩新生儿中,早产比例从21.4%下降到20.4%(P=0.27),剖宫产发生率从65.2%下降到62.9%(P=0.029)。1695名住院新生儿被诊断为脑损伤,脑损伤发病率从17.4%增加到35.1%(P<0.001),脑损伤后遗症的发生率2.3%上升到3.97%(P=0.443)。2.高危因素分析:(1)新生儿入住NICU高危因素:出生体重风险最大为1000~1499g(OR=3.185,95%CI 2.258-4.491,P<0.001),性别(OR=0.854,95%CI 0.778-0.937,P<0.001),1分钟Apgar评分风险最大为4~7分(OR=4.211,95%CI 3.277-5.412,P<0.001)等。(2)脑损伤高危因素:胎龄风险最大为34~36+6 W(OR=1.55,95%CI1.341-1.792,P<0.001),1分钟Apgar评分风险最大的为<4分,不同分娩方式中剖宫产风险最大(OR=1.499,95%CI 1.102-2.038,P=0.01),单胎或多胎(OR=2.051,95%CI 1.821-2.312,P<0.001)等。3.住院新生儿中,呼吸系统疾病占34.6%,比例最高,顺位第二位的是黄疸,占25.9%,神经系统疾病顺位第四位占14.8%。4.不同亚组比较分析:(1)脑损伤影像学结果分正常,轻度异常,严重异常三组,发现:结局中脑瘫(χ2=13.871,P=0.001),和智力缺陷(χ2=6.332,P=0.042),统计上有差异。(2)不同胎龄段分早期早产儿,晚期早产儿和足月儿三组。三组住院发病率、脑损伤发生率、脑损伤后遗症发生率比较,(χ2分别为8551.7,17.28,22.16,P均<0.001)。结论1.剖宫产发生率呈下降趋势。新生儿脑损伤的发生率趋于上升现象。2.新生儿入住NICU和是否发生脑损伤的危险因素不完全相同。3.不同影像学结果及不同胎龄脑损伤及后遗症发生率不同。第二部分ATG5和ATG7基因多态性与小儿脑瘫的关联性研究目的采用大样本病例-对照研究,通过分析脑瘫患儿ATG5和ATG7的基因多态性,在中国汉族人群中探讨自噬相关基因和脑瘫易感性之间的关系。方法本研究选择715例脑瘫患儿为实验组,同期随机选择658例体检儿童为对照组,两组年龄等基本信息比较均没有统计学差异。分别选择ATG5的5个SNP位点(rs573775,rs510432,rs6568431,rs2299863和rs3804338);ATG7的6个SNP位点(rs11706903,rs2606750,rs346078,rs4684787,rs1470612和rs2594972),使用Massarray分型技术对两组进行基因分型。使用SHEsis在线软件进行基因数据分析,每个SNP的多重检验均使用SNPSp D在线系统进行校正。以P<0.05作为差异有统计学意义的检验水准。结果1.总体结果:ATG5基因的rs6568431位点的基因型及等位基因型频率在脑瘫组和正常对照组间比较有统计学差异,P值分别为0.0005和0.0015;ATG7基因的rs14706126和rs2594972两个SNP位点的基因型及等位基因型频率在脑瘫组和正常对照组间比较有差异,P值分别为0.02、0.0004和0.044、0.0012。2.亚组分析显示:1)性别分析:ATG5基因的rs6568431位点等位基因频率和基因型频率在男性脑瘫组与男性对照组间存在显著差异(P=0.005和0.004);ATG7基因的rs1470612和rs2594972位点等位基因及基因型频率在男性脑瘫组和男性对照组比较存在统计学差异(P=0.02,0.0004,0.044和0.0012);(2)新生儿期并发症分析:ATG5基因rs6568431位点等位基因频率和基因型频率脑瘫伴HIE组与对照组间比较存在显著差异(P<0.0001和P=0.0005);ATG7基因rs2594972位点等位基因频率在脑瘫伴PVL组与对照组间比较存在差异(P=0.016);同样rs2594972位点的等位基因频率和基因型频率在脑瘫伴HIE组与对照组间比较存在显著差异(P均<0.0001),伴或不伴HIE的脑瘫患儿在位点rs2594972的等位基因频率和基因型频率比较存在显著差异(P均<0.0001);(3)脑瘫类型分析:ATG7基因的rs1470612,rs2594972位点在痉挛型脑瘫和对照组间比较等位基因频率和基因型频率均存在统计学差异,除rs1470612基因型频率外,存在统计学差异(P均<0.05)。另外,rs11706903、rs4684787、rs1470612和rs2594972位点的等位基因和基因型频率在痉挛型双瘫组与对照组之间除rs4684787处的基因型频率外都有统计学差异(P均<0.05);(4)母孕期并发症分析:ATG5基因脑瘫患儿母孕期是否存在胎膜早破与对照间比较,rs573775位点等位基因频率和基因型频率分布存在差异(P=0.015和0.04);ATG7基因脑瘫患儿母孕期是否存在胎膜早破与对照组比较,rs1470612和rs2594972位点等位基因频率和基因型频率分布存在显著差异(P均<0.05);(5)脑瘫伴有合并症分析:ATG5基因的脑瘫患儿伴有智力低下组和不伴有智力低下组分别与对照组比较,rs6568431位点的等位基因频率和基因型频率分布均存在显著差异(P=0.015和0.02);(6)其它亚组分组与对照组间没有差异(P>0.05)。注:以上结果中所有有统计学意义的P值均为通过SNPSp D校正后的P值。结论1.ATG5和ATG7基因多态性与脑瘫的易感性相关;2.ATG5和ATG7基因多态性与脑瘫患儿性别相关,ATG5基因与脑瘫患儿伴有PROM和智力低下相关,ATG7基因与脑瘫患儿伴HIE和痉挛型双瘫有关。第三部分脑瘫患儿ATG7启动子荧光素酶基因活性的测定目的采用克隆ATG7基因启动子的方法,插入萤光素酶报告基因载体,检测不同组别荧光素酶表达量的差异,探讨其于小儿脑瘫的可能关系。方法采用细胞质粒转染和luciferase检测技术,在工具细胞293T细胞(人胚胎肾细胞)中扩增ATG7启动子,插入荧光素酶报告基因载体p GL3-empty CON080,将重组质粒转染293T细胞,选取不同的SNP位点野生型和突变型,测定其启动子的转录活性(ATG7的rs1470612和rs2594972位点),并与SV40病毒转化的启动子活性进行比较。使用SPSS17.0进行统计学分析,单因素分析,计量资料以均数±标准差表示,采用t检验进行比较,以P<0.05作为差异有统计学意义的检验水准。结果1.构建了ATG7基因不同位点启动子的荧光素酶报告基因;通过测序及质粒酶切鉴定,所构建的ATG7基因的启动子正确;2.活性测定表明,报告基因在重组质粒转染293T细胞SV40病毒转染后及不同基因位点中显示构建ATG7基因不同启动子活性,并呈现一定的剂量效应;3.ATG7基因的rs1470612和rs2594972位点的荧光素酶检测比较,突变型luciferase相对表达量均降低,野生型和突变型间存在差异(P<0.0001和P=0.009)。结论ATG7基因突变后荧光素酶表达量下调,在rs1470612和rs2594972位点发生基因突变与脑瘫疾病存在关联性。