论文部分内容阅读
急性肾损伤（Actue kidney injury）是一种临床较为常见的疾病,伴随着各种药物在临床上的广泛运用,AKI的发生频率随着时间逐年升高。在临床中,顺铂是一种常常被运用于治疗不同恶性肿瘤的化疗药物,例如非小细胞肺癌、前列腺癌等。研究发现顺铂主要的代谢器官为肾脏,因此肾脏常常成为顺铂毒性沉积的靶器官,基础研究发现根据顺铂在治疗过程中使用的浓度不同,其可对肾脏造成不同程度的损伤,比如低浓度的顺铂可以诱导肾小管细胞凋亡,高浓度的顺铂可以导致肾小管细胞的坏死。大量的临床数据发现顺铂导致的肾毒性常常是肿瘤化疗过程中不可避免的严重不良反应,大约30%的化疗患者会出现顺铂导致的AKI。目前的研究发现顺铂导致肾脏损伤主要作用靶点在肾小管上皮细胞,当肾小管上皮细胞受损时可分泌多种炎症因子,这又进一步加重AKI的发展,顺铂导致急性肾损伤的致病机制主要是炎症反应、线粒体损伤和氧化应激等。LIGHT是肿瘤坏死因子超家族成员之一,自从被发现以来,LIGHT作为一种重要的炎性细胞因子。研究发现,LIGHT可以通过调节炎症反应和线粒体凋亡参与多种疾病的病理发生,通过促进或者降低炎症因子分泌参与动脉粥样硬化、糖尿病、过敏性哮喘、自身免疫性肠病的发生发展,通过促进线粒体介导的细胞凋亡参与肿瘤细胞、神经元细胞的损伤。目前的研究未发现LIGHT在顺铂导致的AKI中具有作用。本研究通过建立顺铂导致急性肾损伤模型,引入LIGHT基因缺陷小鼠,探讨了LIGHT在顺铂急性肾损伤中的作用。【研究目的】1、明确顺铂诱导急性肾损伤中LIGHT的作用;2、探讨顺铂诱导急性肾损伤中LIGHT的分子机制。【研究方法】1、体内实验（1）动物分组及AKI模型建立选取8-12周龄,22-24g雄性小鼠,野生型(LIGHT+/+)小鼠和LIGHT基因敲除(LIGHT-/-)C57BL/6小鼠,腹腔单次注射顺铂（20mg/kg,200μL）或等体积生理盐水,72 h后,眼球取血后处死小鼠,同时收集肾脏组织。（2）利用西南医院检验科全自动生化分析仪检测血清中尿素氮（BUN）及肌酐（Scr）水平;HE染色检测小鼠肾组织病理学改变并进行双盲评分;免疫组化及免疫荧光检测LIGHT在肾组织中的表达情况;定量PCR检测小鼠肾组织中LIGHT,肾损伤分子1（KIM-1）,白细胞介素6（IL-6）,单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）,白细胞介素1β（IL-1β）,肿瘤坏死因子α（TNF-α）的mRNA水平;透射电镜观察小鼠肾小管上皮细胞内线粒体结构情况;Tunel染色检测顺铂处理前后小鼠肾脏组织中细胞凋亡情况;Western Blot法检测肾组织LIGHT,LTβR,HVEM,Bcl2,BAX,细胞色素C,Cleaved Caspase3,Cleaved Caspase9,NF-kBp65,NF-k Bpp65等蛋白水平。2、体外实验（1）体外培养人肾小管上皮细胞（HK-2 cells）,以37℃、5%CO2、95%空气的恒温培养箱孵育,5×105/孔接种24孔板,当细胞密度达到80%-90%时加入1mg/m L顺铂及100ng/m L人重组LIGHT,刺激后24h后收集细胞.（2）通过利用流式细胞技术方法来检测HK-2细胞顺铂或（和）重组人LIGHT刺激后导致的细胞凋亡、ROS以及线粒体膜电位变化;利用定量PCR检测HK-2细胞在顺铂或（和）重组人LIGHT刺激前后炎症因子单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）,肿瘤坏死因子α（TNF-α）,白细胞介素6（IL-6）,的mRNA水平;Western Blot法检测HK-2细胞中LIGHT,LTβR,HVEM,Bcl2白细胞介素1β（IL-1β）,BAX,细胞色素C,Cleaved Caspase3,Cleaved Caspase9,NF-kBp65,NF-k Bpp65等蛋白水平。【研究结果】1、体内实验1.1定量PCR、Western blot提示:顺铂诱导后肾脏组织中LIGHT及其受体LTβR,HVEM表达升高,免疫组化及免疫荧光结果提示:LIGHT高度表达于肾小管上,提示LIGHT-LTβR/HVEM信号通路可能参与了顺铂诱导的肾小管细胞的损伤。1.2在顺铂诱导的急性肾损伤中:全自动生化分析仪结果提示LIGHT-/-小鼠血清尿素氮及肌酐水平较LIGHT+/+小鼠组显著升高;肾脏病理外观、HE染色以及双盲评分也提示LIGHT-/-小鼠肾损伤明显高于LIGHT+/+小鼠。1.3透射电镜观察肾小管上皮细胞内线粒体结构,结果提示:LIGHT基因缺陷后可以加重顺铂对肾小管上皮细胞内线粒体内部结构的损伤。1.4定量PCR、TUNEL染色、Western Blot结果提示:LIGHT基因缺陷后促进肾脏炎症因子的分泌以及肾小管细胞凋亡。2体外实验2.1流式细胞技术结果提示:在顺铂处理的HK-2细胞中,给予重组人LIGHT蛋白后可以减轻顺铂诱导的人肾小管上皮细胞的凋亡以及氧化应激。2.2定量PCR结果提示:在顺铂处理的HK-2细胞中,给予重组人LIGHT蛋白可以减轻顺铂诱导的肾小管上皮细胞的炎症反应,减少炎症因子IL-6,IL-1β,MCP-1,TNF-α的分泌。2.3 Western Blot结果提示:相同剂量的顺铂处理中,给予重组人LIGHT蛋白的细胞中凋亡相关蛋白Bcl2,BAX,Cleaved Caspase-3,Cleaved Caspase-9,NF-k Bp65,NF-kBpp65等蛋白水平显著下调。【主要结论】1、在顺铂诱导的急性肾损伤中,LIGHT不仅参与并在其中发挥着重要的作用;2、在顺铂诱导的急性肾损伤中,LIGHT基因缺陷后导致的细胞凋亡与线粒体氧化应激、Bcl2家族表达紊乱有关;3、LIGHT通过下调线粒体介导的细胞凋亡途径减轻顺铂导致的肾小管上皮细胞损伤;4、重组人LIGHT可以显著减轻顺铂导致的HK-2细胞的炎症反应、氧化应激以及细胞凋亡。