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创伤性脑损伤（Traumatic brain injury, TBI）是神经外科最常见的疾病之一，具有高发病率、高致残率和死亡率的特点。TBI后的继发性脑损害可以导致神经功能缺失、智力障碍，给家庭和社会带来了巨大的痛苦和损失，已成为全球性的社会问题。早年关于颅脑损伤导致神经元死亡的探索主要集中在细胞凋亡方面，经过多年研究其发生过程及通路已经较为清楚。近年来真核生物中细胞自噬发挥的作用越来越多的被人们所重视，成为了科学界的研究热点。最近的研究证实自噬存在于TBI损伤后的病理过程中，对自噬调控的深入研究或许是会为治疗TBI后神经元继发性损伤和修复提供新的药物作用靶点。因此，搞清神经细胞自噬的发生过程及调控靶点，阐明TBI后神经细胞的最终死亡通路，对于探讨和避免TBI后神经细胞的损伤和死亡，同时给予针对性的治疗具有重要意义。以往本实验室的研究发现TBI后自噬主要发生在神经元而非胶质细胞中，并对神经元中ERK1/2及JNK信号通路诱导其自噬的机制进行了系列研究，但将神经元自噬作为药物的作用靶点仍需进一步的探讨。另一方面，胶质细胞作为脑组织中含量最多的细胞，其中的重要因子谷氨酸转运体1（GLT-1)能否对TBI后的神经元自噬发挥调节作用呢？这也需要我们进一步的实验和探索。目的：本实验通过应用自噬抑制剂氯喹和GLT-1激活剂头孢曲松进行干预，检测药物对创伤大脑海马区GLT-1、炎性因子IL-1及自噬相关蛋白LC3表达的影响，为以神经元自噬作为治疗靶点的研究开辟新的思路，也为临床脑损伤的治疗提供实验依据。方法：将160只SD雄性大鼠随机分为4组：①Sham组（n=40），②TBI组（n=40）③氯喹组（n=40）④头孢曲松组（n=40）。每组分为创伤后12h、24h、48h及72h四个时间点。使用Marmarou法建立中度弥漫性TBI模型。对下列指标进行检测：①H E染色观察海马区形态学变化；②干湿比重称量法检测脑组织含水量；③免疫组化共聚焦法检测LC3的表达定位情况；④W estern-blot法检测GLT-1、IL-1和LC3的蛋白表达。⑤另取40只大鼠在创伤后7-11天行Morris水迷宫测试，对其空间学习和记忆能力进行检测。实验结果的定量采用Gel-Doc软件分析系统。实验数据采用均数±标准差，统计分析使用SPSS18.0。两两比较使用q检验，组间比较使用单因素方差分析，P＜0.05表示差异具有统计学意义。结果：1HE染色结果：Sham组海马区的神经元结构完整、数目较多、排列规则，无明显的病理学改变。TBI组创伤后组织疏松，明显水肿，微血管周围间隙和细胞周围间隙的增宽显著；海马区神经元结构破坏、排列紊乱、数量显著减少，胞浆的嗜色性明显减弱，核固缩，核仁部分消失。氯喹组组织水肿较轻，微血管周围间隙和细胞周围间隙只可见轻度增宽；海马区神经元结构相对完整，数目与TBI组比较略有增多，胞核固缩较TBI组明显恢复。头孢曲松组组织水肿不明显，微血管周围间隙和细胞周围间隙略有增宽；海马区的神经元结构较完整，数目与TBI组比较有所增多，胞核固缩较TBI组明显恢复。2大鼠的空间学习记忆功能检测结果：TBI组的平均逃避潜伏期与Sham组比较显著增加（P＜0.05）。氯喹组在9、10天与TBI组相比平均逃避潜伏期显著缩短（P＜0.05）。头孢曲松组在伤后7-10天与TBI组比较平均逃避潜伏期显著缩短（P＜0.05）。在创伤后11天的空间搜索实验过程中，与Sham组相比，TBI组穿越平台次数、平台所在象限路程比及时间比均显著减少（P＜0.05）；与TBI组相比，氯喹组以及头孢曲松组穿越平台次数和2个比值均显著增加（P＜0.05）。3脑组织水含量测定：Sham组在各个时间点的脑组织水含量未见差异。TBI组的脑组织水含量随时间升高，在12-72h均显著高于Sham组。氯喹组24-72h的含水量显著低于TBI组（P＜0.05）。头孢曲松组12-72h的含水量均显著低于TBI组（P＜0.05）。4GLT-1的Western blot检测结果：Sham组GLT-1有较强的表达，表达量在各时间点无差异。与Sham组比较，TBI组GLT-1的蛋白表达量伤后12h出现明显降低（P＜0.05），24h最低，虽然之后有所上调，但在创伤后72h的表达依然低于Sham组（P＜0.05）。头孢曲松组GLT-1表达量显著高于TBI组，在伤后12-72h的差异具有统计学意义（P＜0.05）。5IL-1的Western blot检测结果:Sham组仅有少量IL-1表达，其表达量在各时间点无差异。TBI组与Sham组比较，伤后12h增高（P＜0.05），24h达到高峰（P＜0.05），持续高表达至创伤后48h（P＜0.05），创伤72h后IL-1蛋白表达有所下降，但仍显著高于Sham组（P＜0.05）。氯喹组IL-1蛋白表达随时间变化的趋势与TBI组类似，其表达量略低于TBI组，在伤后24h和48h的差异具有统计学意义（P＜0.05）。头孢曲松组表达量显著低于TBI组，其在伤后12-72h的差异具有统计学意义（P＜0.05）。6LC3与NeuN的共聚焦检测结果:FITC标记的绿色荧光显示自噬标记物LC3的表达，TRITC标记的红色荧光显示神经元标记物NeuN的表达。在TBI后24h，NeuN（红色）与LC3（绿色）在海马区存在共定位。7LC3western blot检测结果:Sham组LC3Ⅱ和LC3Ⅰ蛋白表达量的比值在各时间点无变化。TBI组与Sham组比，在伤后12h开始LC3Ⅱ/LC3Ⅰ有所升高（P＜0.05），在24h达到高峰（P＜0.05），创伤后48-72hLC3Ⅱ/LC3Ⅰ有所下降，但仍高于Sham组（P＜0.05）。氯喹组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ显著低于TBI组，在伤后12-48h的差异具有统计学意义（P＜0.05）。头孢曲松组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ略低于TBI组，在伤后24-48h的差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论：在大鼠弥漫性脑创伤中，自噬抑制剂氯喹和GLT-1激活剂头孢曲松均能影响自噬相关蛋白LC3的表达，达到调控神经元自噬的目的，同时具有一定的抗炎及抗兴奋毒作用，改善了脑创伤后大鼠学习和记忆功能，起到了神经保护作用。