2009年3月,在墨西哥暴发的“人感染猪流感”疫情,并迅速在全球范围内蔓延。经研究确定,此次疫情是由一个新型H1N1病毒亚型引起的,人群没有天然免疫力,疫情几经在全球范围传播。据世卫组织最新数据,全球有214个国家和地区报告了甲型流感确诊病例,出现至少18449个死亡病例。甲型H1N1流感对人及动物的健康造成巨大的影响,并且对社会造成了巨大的经济损失。鉴于甲型流感对畜牧业及人类公共卫生安全造成的巨大威胁,进行对甲型流感抗原实施监测以及时了解甲型流感的流行状况尤为重要,但目前市场上还没有检测甲型H1亚型猪流感病毒抗原(北美流感)的试剂盒,也无区分甲型H1亚型猪流感病毒(北美流感)和经典H1亚型流感病毒的鉴别诊断试剂盒,因此建立一系列简便快速、特异敏感、直观有效的用于甲型流感病毒的检测方法迫在眉睫。本课题研究过程中制备了多株抗甲型H1亚型流感病毒血凝素的单克隆抗体,并以此抗体作为原材料,分别建立甲型H1亚型流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法和甲型H1亚型流感病毒免疫胶体金检测方法,其分别具备灵敏度高、特异性强、操作简便以及可以批量测定等优点和简便快捷、特异性强的优点。为进一步诊断和监测甲型H1亚型流感抗原奠定了物质基础。1.甲型H1亚型流感病毒血凝素单克隆抗体的制备本研究通过接种、增殖甲型H1亚型流感病毒,将收获的尿囊液用甲醛灭活。用纯化后病毒免疫Balb/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。采用血凝抑制实验筛选,经过有限稀释法对其进行克隆,经过2次融合共获得10株能稳定分泌抗甲型H1亚型流感病毒血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并得到特异性好、效价高的单克隆抗体。所得杂交瘤细胞株分别命名为1C9、2B3、2C5、2H7、3G12、4D7、4B12、4E1、5D5、5F7,腹水HI效价均在213～219,经试验测定,其中7株抗体只与甲型H1亚型流感病毒发生血凝抑制反应,而不与经典H1亚型猪流感病毒及其它亚型流感病毒不发生交叉反应,具有良好的特异性,其余3株单克隆抗体不仅与甲型H1亚型流感病毒发生血凝抑制反应,而且与部分经典H1亚型猪流感病毒发生血凝抑制反应,对其它亚型流感病毒反应结果为阴性。2.甲型H1亚型流感病毒检测方法的建立以抗甲型H1亚型流感病毒血凝素单克隆抗体基础,分别建立甲型H1亚型流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法和甲型H1亚型流感病毒免疫胶体金检测方法,其分别具备灵敏度高、特异性强、操作简便以及可以批量测定等优点和简便快捷、特异性强的优点。这两种方法对其它亚型的流感病毒进行检测,如：经典H1亚型、H3亚型、H5亚型、H9亚型的流感病毒,结果显示均为阴性；并且这两种方法对畜禽类主要病毒进行检测,如：将猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪乙脑病毒(JEV)、鸡新城疫病毒(NDV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、鸡减蛋综合症病毒(EDSV),结果显示均为阴性,说明这两种方法具有很好的特异性。以甲型H1亚型流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法为基础组装的甲型H1亚型流感病毒双抗体夹心ELISA试剂盒,弥补了目前市场上还没有检测甲型H1亚型猪流感病毒抗原(北美流感)的试剂盒,也无区分甲型H1亚型猪流感病毒(北美流感)和经典H1亚型流感病毒的鉴别诊断试剂盒的空白。以上两种检测甲型H1亚型流感病毒的方法,均能够准确、快速检测出畜群及人群中的甲型H1亚型流感病毒,对甲型H1亚型流感病毒的评估、预防及流行病学调查具有极其重要的意义。