巴斯德毕赤酵母（P. pastoris）表达系统是目前应用最广的真核表达系统之一，己有近1000种异源蛋白利用该系统获得了成功表达，市场前景广阔。但是，虽然已有三十余年的应用历史，对毕赤酵母发酵工艺的优化研究始终未取得突破性进展。发酵是一种间歇性稳态的生物学过程，涉及基因组、蛋白质组和代谢组等水平的显著改变。因此，从组学水平上对发酵过程的内在变化进行展示，找到引导稳态间迁移的核心基因、蛋白或小分子底物，可能有助于深度优化发酵工艺。然而，目前关于毕赤酵母重组表达菌株发酵工艺过程的转录组学研究鲜有开展。本论文采用自主设计的基因芯片，试图通过筛查与毕赤酵母发酵工艺重要时间节点密切相关的关键基因，深入研究影响发酵工艺和目的蛋白表达水平的内在因素，为该经典发酵工艺的进一步优化提供数据基础和全新视角。为实现上述研究目标，本论文主要按照如下实验方案开展了研究工作：1.毕赤酵母发酵工艺模型的构建：选择研究背景清晰、发酵工艺成熟的GS115毕赤酵母菌株作为表达载体，成功构建出能够稳定表达reFIP-vvo和rHSA的重组表达菌株。通过中试工艺的对比研究，发现rHSA重组菌株的发酵过程更具标志性，生物规律节点非常明确，故选作理想模型进行后续转录组学研究。2.毕赤酵母基因芯片的制备：使用GeneMark方法预测GS115毕赤酵母基因组中外显子，经多步筛查、验证和优化等步骤自主设计出包含5040个基因的GS115毕赤酵母基因芯片，并完成了芯片的标准化和制备工作。3.毕赤酵母发酵工艺的基因芯片分析：采用自主设计的基因芯片，对毕赤酵母发酵工艺中的重要环节进行了转录组学水平的研究，重点了关注碳源置换和甲醇诱导两个生物学过程。另外，鉴于氧分子在该发酵工艺中的主导作用，本研究还采用了构建氧化还原功能树的全新分析手段，特别关注了氧化还原功能相关的基因在好氧代谢流漂移当中的作用。通过上述实验内容的开展，本论文主要获得了如下研究结果：1.本研究设计并制备了毕赤酵母GS115菌株表达谱芯片，填补同领域国内外空白，为毕赤酵母在其他领域的转录组学研究提供了重要的研究工具。2.研究发现在限制性碳源置换阶段，碳源饥饿这个传统的工艺环节可能并不必要，甚至可能有害。分析依据为：a.碳源饥饿造成转录调控功能受到较大抑制，菌体产生严重应激反应；b.甘油补加阶段即检测到目的蛋白表达，表明AOX1可能受到甘油的诱导。因此，使用甘油/甲醇混合补料可能更为科学，即逐渐增加甲醇的比例以实现完全替换，而且这种连续、渐变的工艺过程也更加符合发酵工程的原理。3.筛选到两个可能主导好氧-厌氧代谢漂移的核心基因，即PAS_chr2-1₀582和PAS_chr3₀845。其中，PAS_chr2-1₀582可能是毕赤酵母中调节和控制有氧代谢的最重要转录因子之一。而PAS_chr3₀845可能通过呼吸电子传递链的子功能辅助了厌氧与好氧代谢之间的漂移。对两者的深入研究可能有助于深度优化毕赤酵母发酵工艺，提高目的蛋白的表达水平。本论文利用了自主设计的毕赤酵母基因表达谱芯片对甲醇诱导毕赤酵母重组表达外源蛋白的发酵工艺进行了研究，在转录组学水平上充分地展示了在限制性碳源置换和甲醇诱导表达重组蛋白两个生物学过程以及在好氧代谢漂移中发挥重要作用的功能及核心基因，并对经典的发酵工艺环节与毕赤酵母细胞内生命活动变化之间的关系进行了系统地分析，为该经典发酵工艺的进一步优化提出了方向。