背景和目的糖尿病足是糖尿病的主要并发症之一,其创面常迁延不愈,在发达国家用于糖尿病足护理治疗的花费占糖尿病相关总医疗资源的20%,在发展中国家,这一比例甚至高达40%,给患者和社会带来了沉重的经济负担。因此,糖尿病创面难愈的研究已成为该领域的研究热点。DMSO是一种最为常用的溶剂,可以溶解很多极性或者非极性的化合物。除作为溶剂外,DMSO具有转运小分子药物穿透皮肤而被发展外用型小分子药物载体。另外,研究还发现,DMSO自身具有药用价值,2007年发现DMSO可以降低闭和性颅脑损伤颅内压,随后FDA批准了DMSO可用于减轻闭合性颅脑损伤脑组织膨胀的临床研究,DMSO的药用价值探究再次被点燃。目前难愈性创面的治疗方式更多是通过物理性方式改善创口组织细胞生长的愈合微环境,仍缺乏有效促进难愈创面愈合的药物。有文章报道DMSO促进伤口愈合的作用,但具体机制尚未阐明。同时,我们前期发现,DMSO具有促进与细胞增殖相关的mTOR信号通路激活的功能,而且是否通过此通路影响成纤维细胞增殖,而促进难愈创面愈合仍需进一步探索。在难愈性创面愈合过程中,成纤维细胞和角质细胞增殖及迁移是重要的环节,细胞增殖和分化都是细胞周期循环的结果,细胞周期包含G1期、S期、G2期和M期四个阶段。细胞周期受到细胞周期蛋白Cyclin、细胞周期蛋白依赖性激酶CDK和细胞周期依赖性激酶抑制剂CKI的调控,目前已经发现的细胞周期蛋白有CyclinA/B/C/D/E/G/H,其中Cyclin D1和Cyclin E在推动细胞周期从G1期向S期发展有重要作用。细胞周期蛋白依赖性激酶CDK是隶属于丝氨酸和苏氨酸激酶家族,不同的细胞周期蛋白激酶CDK和不同的细胞周期蛋白Cyclin结合调控细胞周期的不同阶段,例如:CDK2与细胞周期蛋白A和E结合,促进细胞周期从G1期向S期转化。而许多难愈合创面中,成纤维细胞常出现细胞周期阻滞现象,而阻碍细胞增殖影响创面愈合。翻译调控是基因表达调控的重要环节,mTOR通路在蛋白质翻译调控中发挥重要作用。细胞可在mRNA含量较低的情况下,通过调控蛋白质翻译机,快速合成大量蛋白质,从而调控细胞生命活动。真核mRNA翻译成蛋白质有两种途径,即5￠-Top途径和5￠-Cap依赖性途径。其中5￠-Cap依赖性翻译途径是真核细胞mRNA的主要翻译途径,约80-90%mRNA,特别是多数参与细胞增殖和生长的基因均通过此途径翻译成蛋白质。此翻译途径需在mRNA的5￠端加一个7-甲基鸟嘌呤的帽子结构(m7GpppX),此帽子结构在帽依赖性mRNA翻译中起重要作用。eIF4F复合物是由eIF4E、eIF4G和eIF4A组成的异三聚体复合物。真核翻译起始因子eIF4E通过特异性高亲和力与mRNA的5￠帽子结构结合,并招募eIF4G和eIF4A结合到mRNA 5￠端。真核翻译起始因子4E结合蛋白1(4E-BP1,一个翻译负性调控因子)可与eIF4E牢固结合,竞争性抑制eIF4E与eIF4G相互作用;eIF4G在复合物中起支架作用,它含有eIF4E和eIF4A结合位点,并且充当核糖体结合到mRNA的衔接蛋白;eIF4A具有解螺旋酶活性,解开mRNA 5’非编码区的双链结构,利于核糖体向下游扫描起始密码子。mTOR通路是调控蛋白质翻译的关键通路,若mTOR分子发生磷酸化而被激活,活化的mTOR进一步诱导4E-BP1的磷酸化,4E-BP1因磷酸化而失活,失活的4E-BP1便从4E-BP1/eIF-4E复合物中解离,释放被其禁锢的eIF4E,游离的eIF4E进而招募eIF4G、eIF4A形成eIF4F起始因子复合物,同时结合到mRNA 5￠-末端的帽子结构上,促进翻译过程,进而促进细胞的增殖。本研究基于前期团队发现,即DMSO具有激活mTOR信号的能力的基础之上,较系统地探讨DMSO通过增强成纤维细胞增殖促进糖尿病小鼠难愈创面愈合的作用机制,本项目的完成将阐述DMSO的促愈机制,并为基于DMSO研发促愈新药提供理论支撑。方法首先,不同浓度的DMSO处理糖尿病小鼠创面模型,观察糖尿病小鼠创面愈合情况并检测细胞增殖核心蛋白ki67的表达水平。然后,从糖尿病小鼠模型获得糖尿病小鼠原代成纤维细胞,不同浓度的DMSO作用于糖尿病小鼠原代成纤维细胞,MTT、RTCA和EDU实验研究DMSO对糖尿病小鼠原代成纤维细胞增殖的影响;流式细胞术检测DMSO处理后糖尿病小鼠原代成纤维细胞的细胞周期变化;定量RT-PCR和western-blot检测包括Cyclin D1在内的细胞周期相关蛋白和激酶的mRNA与蛋白的表达水平;western-blot和Pull Down时间检测蛋白质翻译调控重要信号通路—mTOR信号通路及其下游关键蛋白表达水平;polysome实验检测Cyclin D1的蛋白质翻译水平。结果1、与对照组相比,WB结果显示,低浓度DMSO能增加创面新生组织细胞增殖核心蛋白Ki67的表达,峰值出现于伤后8天,对糖尿病小鼠难愈创面的愈合起加速作用。2、MTT、EDU掺入和RTCA实验显示,低浓度的DMSO能促进糖尿病小鼠原代成纤维细胞的增殖,其中5μM浓度显示结果最强,而大于20μM的DMSO则对细胞增殖有抑制作用。另外,流式细胞检测结果显示,DMSO可加速糖尿病小鼠原代成纤维细胞细胞周期由G1期向S期转变,进而促进细胞增殖。3、WB结果显示,低浓度DMSO可上调mTOR及其下游蛋白4EBP1的磷酸化而激活mTOR信号通路;同时,Pull-down实验结果显示,受mTOR信号所调控的真核细胞蛋白质翻译起始复合物eIF4F的形成增加;WB结果却证实,DMSO显著上调细胞周期蛋白Cyclin D1蛋白的表达,但RT-PCR结果显示,Cyclin D1基因mRNA的表达不受DMSO影响。而上述变化可被mTOR抑制剂雷帕霉素所抑制。Polysome实验证实DMSO上调了Cyclin D1蛋白质翻译水平。结论DMSO通过激活mTOR的磷酸化,活化此通路,并诱导此通路下游蛋白4EBP1的磷酸化,解除4EBP1对结合蛋白eIF4E的抑制效应,促进真核翻译起始复合物eIF4F的形成,从翻译水平上调Cyclin D1的表达,进而促进糖尿病小鼠原代成纤维细胞细胞周期由G1期向S期转变,加速细胞增殖,最终促进糖尿病小鼠难愈创面的愈合。