目的据报道世界卫生组织估计全世界有20多亿人饮用酒精性饮料及7.63亿人诊断为酒精性相关性疾病、紊乱症。乙醇及其在体内代谢的一系列中间产物,对机体组织细胞都会产生直接或间接的毒性作用。慢性乙醇中毒是指长期、过量饮酒引起的实质器官病理变化及行为障碍性疾病,导致脑重量变小,大脑萎缩,脑额叶前皮质和其他脑区神经元及胶质细胞密度降低,细胞和白质的缺失,以及永久的认知功能障碍,但其具体机制目前还不清楚。caspase-3是一种天冬酰胺特异酶切的半胱氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate-specific proteinase),正常情况下存在于胞质中。当死亡信号传递至细胞内后,通过一系列级联反应激活caspase蛋白家族,caspase-3的激活(裂解成p11、p17、p19、p20片段)后,进一步传递给后续级联反应至细胞核内,促使细胞发生凋亡。本研究在建立小鼠慢性乙醇中毒的动物模型基础上,应用TUNEL法检测慢性乙醇中毒小鼠大脑皮质神经细胞凋亡变化,及应用免疫组化和Western blot技术检测慢性乙醇中毒小鼠大脑皮质神经细胞caspase-3和NSE的表达,探讨慢性乙醇中毒小鼠大脑皮质神经细胞损伤、细胞凋亡的病理生理机制。实验材料与方法一、动物模型的建立及分组健康成年(8-9周龄)清洁级昆明系雄性小鼠48只,体质量30-42g,随机分为8组,每组6只。其中第一组为90天正常对照组,第二组为90天10%乙醇(V/V)实验组,第三组为90天20%乙醇(V/V)实验组,第四组为90天30%乙醇(V/V)实验组,第五组为180天正常对照组,第六组为180天10%乙醇(V/V)实验组,第七组为180天20%乙醇(V/V)实验组,第八组为180天30%乙醇(V/V)实验组。适应性喂养5天后正常对照组给予饮用纯净水自由饮用,慢性乙醇中毒实验组分别给予无水乙醇与饮用纯净水配制浓度分别为10%、20%、30%的乙醇自由饮用。每日观察各组动物喂养情况及行为变化。90天组饲养90天,180天组饲养180天。各组实验动物到慢性乙醇中毒动物模型终止时间取材。动物取材前,采小鼠尾静脉血0.2ml测血乙醇浓度。取材时,乙醚吸入麻醉后迅速断头,取出整个脑组织,去除小脑和脑干,取大脑以备HE染色、免疫组织化学染色、TUNEL法检测细胞凋亡和Western blot检测应用。二、实验方法应用顶空气相色谱法检测各组小鼠血乙醇浓度,应用免疫组织化学检测各组小鼠大脑皮质神经细胞NSE的表达变化,应用TUNEL法检测各组小鼠大脑皮质神经细胞凋亡变化,应用免疫组织化学检测各组小鼠大脑皮质神经细胞procaspase-3的表达变化,及应用Western blot技术检测各组小鼠大脑皮质procaspase-3和active caspase-3的表达变化。以正常对照组小鼠大脑皮质作对照,显微镜×400倍下,在大脑皮质区随机选取10个视野,计数细胞总数、阳性细胞数及阳性细胞率。应用Motic Image Advanced 3.2图像分析系统计算各组平均积分光密度,测得数据用均数±标准差(x±s)表示。用SPSS13.0 for Windows进行单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。结果在小鼠慢性乙醇中毒制模终止前各慢性乙醇中毒组小鼠出现明显的慢性乙醇中毒表现,较正常对照组小鼠毛发失去光泽、杂乱、稀疏,精神萎靡、易激惹,体重减轻。随着饮酒浓度的增加,90天组内正常对照组与20%、30%乙醇组间小鼠体重增长值差异有统计学差异(P＜0.05),而与10%乙醇组间体重增长值差异无统计学意义(P＞0.05)；180天组内正常对照组与10%、20%、30%乙醇组间体重增长值差异均有统计学意义(P＜0.05)。正常对照组小鼠血乙醇浓度未检出,随着饮酒浓度的增加和饮酒时间的延长,慢性乙醇中毒组小鼠血乙醇浓度也增大,各慢性乙醇中毒组小鼠血乙醇浓度与正常对照组差异有统计学意义(P＜0.05)。慢性乙醇中毒组小鼠大脑质软,组织肿胀,脑沟变浅,大脑皮质变薄。慢性乙醇中毒实验组小鼠大脑切片HE染色显示皮质神经细胞嗜伊红染色增强,轴突肿胀,尼氏体边聚,脑实质内神经细胞、血管周间隙增宽,有的神经细胞核深染,染色质固缩,胞质浓缩,可见噬神经细胞现象。随着饮酒浓度的增加和饮酒时间的延长,小鼠大脑皮质神经细胞NSE表达阳性细胞数逐渐减少,NSE阳性细胞率逐渐降低,慢性乙醇中毒各组与正常对照组间小鼠大脑皮质神经细胞NSE阳性细胞数、阳性细胞率及平均积分光密度差异有统计学意义(P＜0.05)。TUNEL法检测显示随着饮酒浓度的增加和饮酒时间的延长,小鼠大脑皮质神经细胞TUNEL阳性细胞数逐渐减少,阳性细胞率逐渐降低,慢性乙醇中毒各组与正常对照组间TUNEL阳性细胞数、阳性细胞率差异有统计学意义(P＜0.05)。正常小鼠大脑皮质神经细胞表达procaspase-3,随着饮酒浓度的增加和饮酒时间的延长,小鼠大脑皮质神经细胞procaspase-3表达阳性细胞数逐渐减少,procaspase-3阳性细胞率逐渐降低,90天组内正常对照组与20%、30%乙醇组间procaspase-3阳性细胞数、阳性细胞率及平均积分光密度的差异有统计学意义(P＜0.05),而与10%乙醇组间的差异无统计学意义(P＞0.05),180天组内的各组间统计学分析结果和90天组内统计学分析结果一样。Western blot检测结果显示正常对照组小鼠大脑皮质有procaspase-3(32kD)阳性条带无active caspase-3 (17kD)阳性条带,而各慢性乙醇中毒组小鼠大脑皮质有procaspase-3 (32kD)、active caspase-3 (17kD)两条阳性条带,且随着饮酒浓度的增加和饮酒时间的延长,小鼠大脑皮质表达procaspase-3的阳性条带逐渐减弱,而表达active caspase-3的阳性条带逐渐增强,90天组内各慢性乙醇中毒组与正常对照组间procaspase-3、active caspase-3阳性条带间平均灰度值的差异都有统计学意义(P＜0.05),180组内的各组间统计学分析结果和90天组内统计学分析结果一样。结论1、慢性乙醇中毒导致小鼠大脑皮质神经细胞NSE表达降低,神经细胞功能异常。2、慢性乙醇中毒导致小鼠大脑皮质神经细胞凋亡。3、慢性乙醇中毒引起引起小鼠大脑皮质神经细胞caspase-3的激活及其活性caspse-3的表达增加。4、慢性乙醇中毒导致小鼠大脑皮质神经细胞凋亡的严重程度与饮酒时间及饮酒浓度相关,饮酒时间越长、乙醇浓度越高,神经细胞凋亡越多。