论文部分内容阅读
肿瘤是严重危害人类健康的疾病之一。而原发性肝癌以其极高的恶性程度、较差的预后,成为世界范围内肿瘤治疗的难题。据世界卫生组织2002年的统计数据显示,全球每年肝癌新发病例为63万例,死亡人数约60万人。原发性肝癌是我国最常见的难治性恶性肿瘤之一,占我国恶性肿瘤发病率和死亡率的第2位,已经成为我国面临的最为严重的公共卫生问题。化疗是目前恶性肿瘤治疗的常用手段。不同个体在化疗期间肿瘤细胞产生继发耐药性,使其对化疗药物的敏感性发生变化,导致化疗在临床疗效上存在着明显的个体差异以及不确定性,肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性常常导致化疗失败,这是目前临床面临的严峻问题。化疗是目前恶性肿瘤治疗的常用手段。研究肿瘤耐药性相关基因将有助于阐明肿瘤耐药性产生的分子机制,制定合理的化疗方案,寻找和发现新的检测及逆转肿瘤耐药性的方法。本实验室前期研究发现,昆虫对杀虫剂的抗药性和肿瘤细胞对化疗药物的耐药性之间存在着一些相似/相近之处。本实验室近年采用抑制性差减杂交（SSH）结合cDNA芯片和基因转染后高表达及RNA干涉后低表达等方法,分离、鉴定了多个蚊对杀虫剂抗性基因,其中包括视蛋白（opsin）基因。检索发现,蚊视蛋白基因与人视蛋白3基因（OPN3）高度同源。OPN3在人肝癌组织中表达较高,且其在肝癌5-氟尿嘧啶（5-FU）耐药细胞株Bel74025-FU中的表达是敏感细胞株Bel7402的0.37倍,由此推测OPN3可能与肿瘤细胞耐药性相关。OPN3,也被称作encephalopsin或panopsin基因,是一个发现时间不长的视网膜外光感受器基因,其在人体脑、肝、心、肺、骨骼肌、胰腺、胎盘等多种组织中均有表达。OPN3属于一种眼外视蛋白,具有典型的7个α螺旋跨膜结构,属于G蛋白偶联受体超家族（G protein-coupled receptor,GPCR）的成员,它在鼠的脑组织和睾丸组织内有较强和特异的表达。据迄今为止的报告,视蛋白除了参与视觉成像的功能外,尚未见其他功能报告。本研究采用定量PCR方法,检测比较了OPN3在人肝癌5-FU耐药细胞株Bel74025-FU与敏感细胞株Bel7402中的表达差异;在此基础上,构建OPN3的真核细胞表达载体和RNA干涉表达载体,建立了稳定转染Bel74025-FU和Bel7402的细胞系,通过改良MTT法（WST法）分别测定高表达和低表达OPN3后,Bel74025-FU细胞和Bel7402细胞对5-FU敏感性的变化。定量PCR结果显示:OPN3在人肝癌5-FU耐药细胞株Bel74025-FU中的表达是敏感细胞株Bel7402的0.37倍（P<0.05）。转染试验（包括RNA干涉）方法显示:在200μM,300μM, 400μM, 600μM,700μM,800μM浓度的5-FU处理48h后,高表达OPN3的Bel74025-FU细胞的存活率分别下降26.25%,16.81%,21.10 %,8.16%,8.56%和9.83%（P均<0.05）;同时,在20μM,40μM,60μM,80μM,100μM,120μM浓度的5-FU处理48h后,低表达OPN3后的Bel7402细胞的存活率分别升高23.97%,18.99%,24.20%,14.32%,17.29%,11.81% （P均<0.05）。以上结果表明,OPN3高表达能够增加人肝癌细胞对于5-FU的敏感性,OPN3低表达能够增加人肝癌细胞对5-FU的耐药性。根据现有的研究报告,我们推测OPN3可能通过其下游的效应分子干扰了细胞凋亡通路,从而改变了肝癌细胞对抗肿瘤药物5-FU的敏感性。本研究首次发现OPN3与肿瘤耐药性相关的新功能,为进一步探索肿瘤耐药性的分子机制和建立肿瘤耐药性的检测方法提供了实验依据,并为探讨昆虫抗药性与肿瘤耐药性之间的关系提供了新线索,具有重要的科学意义和潜在的应用价值,值得进一步研究。