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研究目的肝移植是目前各种急、慢性终末期肝病及肝衰竭最有效的治疗手段。感染和排斥,仍是肝移植术后最常见的两大并发症。由于肝脏与肠道不仅在解剖结构,而且在功能上有着密切的联系,肠道作为人体最大的贮菌库和内毒素库,在特定条件下可以释放多种毒性物质,导致肠源性感染的发生,并加重肝脏的损害。肝硬化患者肠道菌群发生明显的易位,革兰阴性需氧菌明显增多,以肠杆菌科细菌为主,厌氧菌如双歧杆菌和乳酸杆菌减少,但肝硬化肝移植术后肠道菌群的多样性变化鲜有报道。肠道微生态失衡、肠黏膜屏障损伤和肠渗透性增加、免疫功能失调及手术缺血再灌注损伤等均是造成肝移植后肠道菌群变化的重要原因。本研究应用基于16S rRNA特异性基因的指纹图谱分析(PCR-DGGE)、属特异性引物Real-time PCR对大鼠及成人肝移植后肠道菌群的多样性进行研究,并尝试应用细菌基因组间重复序列的DNA指纹图谱(rep-PCR)技术对肠道菌群多样性变化进行初步研究,探讨大鼠及成人肝硬化肝移植后肠道菌群多样性的变化,观察肠道菌群变化的规律,优化肠道微生态,预防肝移植后感染的发生,为肝硬化、肝移植患者的治疗和预后提供一定的参考价值。材料和方法1、成功建立CCL4诱导的SD大鼠肝硬化模型,选择健康的SD大鼠对肝硬化模型组进行肝移植,采集正常对照组、肝硬化模型组、肝硬化肝移植术后7d组、肝硬化肝移植术后30 d组的粪便标本,于-80℃冰箱保存备用。2、收集健康成人、肝炎肝硬化患者、肝移植术后患者的粪便标本,于-80℃冰箱保存备用。3、提取上述各组粪便细菌基因组DNA,然后用16S rDNA V3区通用引物扩增细菌总DNA,对扩增PCR产物进行变性梯度凝胶电泳(DGGE).4、应用肠道优势菌群属特异性引物,进行6种细菌的Real-time PCR检测,明确这6种优势细菌在大鼠和成人肝硬化肝移植后肠道中的变化情况。5、利用细菌基因组内重复序列引物包括BOX-PCR, ERIC-PCR, ERIC2-PCR, (GTG)5-PCR, REP-PCR对大鼠及成人粪便细菌基因组DNA进行扩增电泳,分析指纹图谱。结果1、成功建立了SD大鼠肝硬化模型(造模组大鼠肝脏病理见假小叶形成),并对其成功进行了肝移植,移植后SD大鼠1只出血死亡,其余排斥反应较轻,移植组大鼠生活良好。2、PCR-DGGE图谱分析可明确将大鼠及成人正常对照组、肝硬化组、肝移植组均分为3个簇,并显示出大鼠肝硬化、肝移植后肠道菌群多样性明显增多,而成人肝硬化、肝移植后肠道菌群多样性有所减少,肝硬化发生过程中,肠道菌群中优势菌群如拟杆菌属(Bacteroides)的数量减少,肠杆菌科细菌如Prevotella菌等数量增多,肝移植后菌群多样性变化有所恢复,但仍未回到正常水平。3、Real-time PCR检测结果显示,肝硬化大鼠中拟杆菌属、梭菌属、双歧杆菌属、乳酸杆菌属细菌明显减少,肠球菌属、肠杆菌属细菌明显增加。而成人中肝硬化组梭菌属、双歧杆菌属细菌明显减少,而肠球菌属细菌明显增加。4、rep-PCR技术也可将大鼠及成人正常对照组、肝硬化组、肝移植组区分开,其中ERIC-PCR、ERIC2-PCR及REP-PCR三者扩增条带各组差异显著,鉴别效果更好。5、PCR-DGGE主要分析肠道内优势菌群的多样性,可明确肠道内优势菌群的种类变化。rep-PCR技术将肠内菌群作为整体,研究微生物菌群多样性的整体变化。rep-PCR和PCR-DGGE技术在大鼠及成人肝硬化肝移植后肠道微生态的研究中具有相似的鉴别力,但PCR-DGGE的分辨率更好。结论SD大鼠及成人肝硬化后肝移植的肠道菌群多样性发生明显变化,其中以肝硬化组变化最为明显,肝移植术后肠道菌群有向正常恢复的趋势。应用rep-PCR和PCR-DGGE技术一样,均可将肝移植前后肠道菌群多样性差异分辨出,尤其是ERIC-PCR、ERIC2-PCR及REP-PCR鉴别效果更好,可为监测菌群多样性变化提供新的简便有效途径。