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目的：筛选能分泌抗人AFP单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并以其为原料构建抗人AFP单链抗体(ScFv)基因，并将基因转入大肠杆菌表达，分离纯化抗人AFP ScFv抗体，并鉴定其活性。方法：利用GENEDOC软件对人AFP及HSA氨基酸序列进行同源比较。用ELISA及斑点印迹方法从已有的杂交瘤细胞株中筛选与人血清白蛋白无交叉反应的杂交瘤细胞株，根据小鼠IgG V区骨架区保守序列合成通用引物，扩增VH上游引物5端和扩增VL下游引物5`端加入限制性内切酶位点，扩增VH下游引物5端和扩增VL上游引物5`端加入连接肽碱基序列，两者有18个碱基互补。用RNA提取试剂和提取杂交瘤细胞总RNA，用RT-PCR方法，分别分离纯化VH和VL基因片段。用重叠延伸PCR方法将VH和VL连接在一起，构建ScFv基因。将ScFv基因克隆至pGEM-T载体，构建重组pGEM-A质粒并转化大肠杆菌DH5α，通过蓝白筛选阳性菌落，提取质粒，通过限制性内切酶切、PCR和测序鉴定。用限制性内切酶双酶切pGEM-A和大肠杆菌TrxA融合蛋白表达pET32(a+)质粒载体，将从pGEM-A质粒上酶切获得的ScFv基因克连接到pET32(a+)质粒中，构建pET-A质粒，转化大肠杆菌BL-21(DE3)，通过诱导表达筛选阳性克隆，再提取质粒，用限制性内切酶酶切、PCR和测序鉴定。将阳性克隆发酵培养，溶解细菌，分离纯化包涵体，用高浓度尿素将包涵体变性溶解，再通过梯度浓度透析复性，获得初纯ScFv。ScFv经亲和层析，Enterokinase消化获得ScFv抗体片段。通过SDS-PAGE电泳，ELISA竞争抑制实验鉴定抗体活性。结果：同源序列四川大学博士论文比较显示:人AFP与HSA有50%氨基酸同源。冻存复舒的3株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体有2株与人血清白蛋白存在严重交叉反应，最后筛选出1株与人血清白蛋白无交叉反应的杂交瘤细胞株用于以后的研究;提取的RNA有285，185，5s三条带明显，无降解;经Rl，一PCR扩增的vH和vL基因大小位于250bP和soobp之间，vH略大于vL;经重叠延伸PCR扩增，将vH和vL连接后构建的ScFv基因大约75obp;酶切及PCR鉴定显示:scFv正确克隆至pGEM一T载体，成功构建了pGEM一A质粒;测序结果显示:ScFv基因由699个碱基组成，其中含339bP的vH和315bp的vL及45bP的连接肤碱基，阅读框架正确;pET-A质粒转化大肠杆菌BL一21(DE3)，诱导筛选出5株有相应分子量大小的阳性菌落，提取质粒，经酶切、PCR、测序鉴定显示成功构建了pET一A质粒，根据测序结果推导scFv由233个氨基酸组成，vH有113个，vL有105个，两者由(G4s)3连接肤连接，与预期结果一致。细菌溶解后反复洗涤可获得较高纯度的蛋白:包涵体变性后采用透析复性的方法可使复性率达74%。SDS一队GE电泳显示厂nxA一scFv融合蛋白分子量约41Kd，酶切后纯化的scFv分子量约27Kd，肠仪A分子量约14Kd。抗体活性经ELISA抑制实验显示，复性后抗体活性为单克隆抗体的25%，经纯化后ScFv抗体活性增加到单克隆抗体的37%。结论:由于人AFP与人血清白蛋白具有50%同源性，以AFP为抗原免疫后制备的单克隆抗体与人血清白蛋白存在较高的交叉反应几率，因此以AFP抗原制备单克隆抗体时应补加人血清白蛋白交叉筛选实验。本研究成功构建了抗人AFP单链抗体基因并在大肠杆菌得到了高效表达，获得的单链抗体具有较高活性。